微波、超高压处理对转基因大豆外源基因降解的影响

王卫国 朱占齐 吴兴泉

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

微波、超高压处理对转基因大豆外源基因降解的影响

王卫国 朱占齐 吴兴泉

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

为了考查不同微波和超高压处理条件对转基因大豆外源基因CP4-EPSPS降解的影响。试验对转基因大豆样品分别微波处理1、2、3、4、5 min或分别用 100、200、300、400、500 MPa超高压处理 10 min，采用PCR检测技术，分析了受处理样品和未处理样品中大豆外源基因的降解结果。结果表明：在微波处理条件下，抗草甘膦转基因大豆的基因组质量浓度随微波处理时间的增加而降低，当处理时间超过3 min和5 min后，其质量浓度降至9 ng／μL和0 ng／μL，PCR检测结果显示，外源基因已被降解到100 bp以下；超高压处理条件下，抗草甘膦转基因大豆基因组质量浓度随着压力的增加而降低，当压力为500 MPa时，基因组的质量浓度降至40 ng／μL，但仍能检测到1 512 bp长度的外源基因片段。与超高压处理相比，微波处理对大豆外源基因的降解更有效。

转基因大豆 CP4-EPSPS 微波 超高压 降解

抗草甘膦转基因大豆，是在传统大豆中转入外源基因CaMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到的。在饲料食品加工过程中，采用恰当的方法将转基因大豆的外源基因充分降解而使其失去活性是近年来广受关注的研究课题。

食品或饲料的粉碎、蒸汽处理、酸碱处理、焙烤、煮沸、挤压膨化等加工方法对转基因大豆外源基因影响的研究已有部分报道［1-5］。但微波处理对转基因大豆外源基因影响的研究较少，而超高压处理对转基因大豆外源基因的影响未见报道。本试验的目的是了解微波处理和超高压处理条件对转基因大豆外源基因CP4-EPSPS的降解作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

转基因大豆样品：郑州阳光油脂有限公司。

1.1.2 CP4-EPSPS基因扩增引物

从Genbank中查询转基因大豆Roundup Ready的P4-EPSPS的基因序列号为 AY125353，其DNA共有 1 946 bp［6］。根据文献［7-9］，设计了扩增不同长度CP4-EPSPS基因片段的引物（引物序列见表1），所有引物均由英骏生物技术有限公司合成。

表1 抗草甘膦转基因大豆外源基因特异性引物序列

1.1.3 试剂

DP-320试剂盒：天根生化科技有限公司；Taq酶、dNTPs、PCR缓冲液、分子量 Marker（100 bp-2 000 bp）：郑州久是生物技术有限责任公司。

1.1.4 主要仪器与设备

9FQ20锤片粉碎机：江西红星机械厂；梯度PCR仪：德国Bio-metra公司；DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；紫外凝胶成像系统：美国Bio-rad公司；900X2超高压设备：包头军工厂。

1.2 方法

1.2.1 样品水分的测定

按 GB／T 5497—1985［10］测定样品的水分。

1.2.2 样品的前处理

挑选籽粒饱满的大豆，粉碎并过60目筛，备用。

1.2.3 微波处理抗草甘膦转基因大豆粉

从经过前处理的备用大豆粉中取5个样品，每个样品量为3.0 g，加入410μL双蒸水，使大豆粉的含水量达到20%，放入微波炉中（输出功率为800 W），按表2方案分别加热处理，然后冷却，提取基因组，进行质量浓度测定和电泳。每个处理3个重复。

表2 抗草甘膦转基因大豆微波处理参数

微波加热的时间参考有关微波加热大豆的研究文献确定［11-12］。

1.2.4 超高压处理抗草甘膦转基因大豆粉

常压密封：取20 g大豆粉溶于100 mL去离子水，经真空包装机密封备用。

超高压处理：将常压真空密封的5个样品分别按表3进行超高压处理，每个样品恒压10 min。超高压处理采用的压力范围和时间参考文献［13-14］确定。

打开包装袋，真空抽滤，常温常压风干后提取基因组，进行质量浓度测定和电泳。每个处理做3个重复。

表3 抗草甘膦转基因大豆超高压处理参数

1.2.5 DNA提取

收集经各工艺条件加工的样品以提取DNA。称取固体样品60 mg，所有样品均采用试剂盒进行DNA提取，方法按照说明书进行。

1.2.6 抗草甘膦转基因大豆DNA质量浓度检测

采用紫外可见光光度计法测定抗草甘膦转基因大豆基因组的质量浓度，按式（1）计算：

式中：cm为总 DNA质量浓度 ng／μL；OD260为紫外可见光光度计读数；λ为50 ng／μL。

1.2.7 PCR扩增

研究检测了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因的4条长度不等的片段，使用未加工转基因大豆外源基因作模板DNA阳性对照，确保试验操作和体系正常，双蒸水空白对照无检测产物出现，说明PCR操作过程无污染。

本试验建立和优化的抗草甘膦转基因大豆粉PCR检测方法均采用相同的PCR反应体系，总反应体积 50μL，10×Buffer 5μL，dNTPs（10μmol／L）2μL，引物（10μmol／L）2μL，Taq酶1 U，模板 DNA 1μL（约100 ng），加双蒸水补足至50μL。

反应在PCR仪上进行，4条不同长度片段的PCR检测反应条件如表4所示。

表4 PCR检测反应条件

1.2.8 最低检测限分析及序列测定

将质量浓度约为50 ng／μL的转基因大豆DNA和双蒸水分别按体积比为1∶1、1∶3、1∶7、5∶95、1∶99的比例充分混合，双蒸水为空白对照，按1.2.5优化的PCR检测方法进行检测，确定加工处理样品总DNA的最低检测限。

将阳性检测产物进行测序，4条片段分别随机测定一个反应，以避免出现假阳性。1.2.9 PCR扩增产物检测

PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上90 V电泳45 min，用凝胶成像仪观察结果。

2 结果与分析

2.1 转基因大豆的水分含量

按1.2.1的GB／T 5497—1985测得的转基因大豆的水分质量分数为9.06%。

2.2 微波处理抗草甘膦转基因大豆DNA的质量浓度

微波处理的抗草甘膦转基因大豆基因组质量浓度的测定结果如表5所示。

表5 经微波处理的抗草甘膦转基因大豆的基因组质量浓度

由表5可见，未加工转基因抗草甘膦大豆DNA的质量浓度约为94 ng／μL，在微波处理的条件下，随着处理时间的增加，提取的DNA质量浓度逐渐降低。当微波处理3 min时，提取的基因组质量浓度骤然降低，当微波处理5 min时，其质量浓度无法检测，几乎为零。A260／A280接近 1.8，A260／A230接近2.5，说明提取的基因组纯度较高，没有蛋白、碳水化合物等杂质的污染。

2.3 抗草甘膦转基因大豆微波处理后外源基因CP4-EPSPS的降解变化

微波处理后转基因大豆基因的电泳图见图1。大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR检测结果见图2。检测中，以未经处理的转基因大豆的外源基因的检测结果作为阳性对照，检测了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因的4条梯度片段。

图1 微波处理的抗草甘膦转基因大豆基因电泳图

在微波处理过程中，对应处理时间1、2、3、4、5 min，样品吸收的能量分别为 48、96、144、192、240 kJ。结合表2、图1和图2进行分析可知，随着微波处理时间的增加，样品中DNA质量浓度急剧下降，当处理时间达到3 min时，其DNA质量浓度仅有9 ng／μL左右；由PCR检测结果可以看出，微波处理1～2 min后，还可以检测出4个条带（图2 a～图2d），表明，外源基因尚未被充分降解。当微波处理时间超过3 min之后，已检测不到≥100 bp的外源DNA片段（图2 a～图2d）。表明，外源基因已经被充分降解。100 bp以下的外源DNA片段已无原有的基因活性。

图2 微波处理抗草甘膦转基因大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR检测

2.4 超高压处理抗草甘膦转基因大豆DNA的质量浓度

超高压处理的抗草甘膦转基因大豆基因组质量浓度的测定结果如表6所示。

表6 超高压处理抗草甘膦转基因大豆基因组质量浓度

由表6可见，A260／A280接近1.8，A260／A230接近2.5，说明提取的基因组纯度较高，没有污染。与未处理的转基因大豆的基因组质量浓度相比，随着压力的增强，超高压处理大豆粉的DNA质量浓度降低，但当压力达到500 MPa时，转基因大豆提取的基因组的质量浓度仍有约40 ng／μL，是未处理大豆所提取的基因组质量浓度的1／2左右，表明超高压处理对大豆基因组的降解或破坏作用远低于微波处理的作用。

2.5 超高压加工对转基因大豆外源基因CP4-EPSPS的降解作用

本研究检测了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因4条梯度片段，在检测的过程中，以未处理转基因大豆外源基因为模板DNA进行检测的结果作为阳性对照，确保试验操作和体系正常，双蒸水空白对照无检测产物出现，说明PCR操作过程无污染。

图3 超高压处理后的抗草甘膦转基因大豆基因组电泳图

从电泳结果可以看出，以未经超高压处理的样品DNA作为模板，对CP4-EPSPS基因不同长度片段进行检测，各处理样品均可检测出4条不同长度片段的条带，说明即使经500 MPa的压力处理10 min，外源基因也未完全降解 （图4），仍能检测出1 512、807、408、206 bp大小的片段（图 4），仅1 512 bp片段的浓度有所降低。

图4 经超高压处理的抗草甘膦转基因大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR检测

3 讨论

3.1 微波处理对抗草甘膦转基因大豆外源基因的影响

抗草甘膦转基因大豆在2 450 MHz微波作用下，所含水分、蛋白质等电解质分子随电场的变化发生高速振动，造成分子间的碰撞和剧烈摩擦，从而产生高热，在较短的时间内会使蛋白质的结构变得松散、降解。张海华等［15］的研究结果表明，微波在加热功率为600、800、1 000 W加热1 min，可削弱面筋蛋白分子间或分子内的非共价作用，使部分二硫键断裂，使面筋蛋白紧密的结构变得松散。而当微波处理时间加长至2 min以上时，由于水分损失，植物籽粒内温度迅速上升，超过100℃，可使转基因植物外源DNA发生有效降解。Song等［16］用微波炉（800 W）处理经煮熟、揉捏、成型、冷却的抗除草剂转基因大米（湘 125S／Bar 68-1）片3 min，其SPS基因（7 150 bp）仅可检测出916、456、277、168 bp的基因片段，而Bar基因（615 bp）仅可检出370 bp和175 bp大小的基因片段。CAMV35S启动子（835 bp）可检测出735、446、195 bp的片段，对 NOS终止子（253 bp）则仅测出180 bp大小的片段。表明不同外源基因和调控原件在相同微波处理条件下的稳定性是不同的，这与其蛋白自身结构与特性相关。Vijayakumar等［17］研究了微波热加工对转基因大豆的影响。用540 W和900 W微波处理样品2 min，GM大豆的DNA浓度从100 ng／mg分别下降到约76 ng／mg和53 ng／mg。从微波处理的GM大豆中可以检测到101 bp的EPSPS的基因片段。本试验结果表明，微波加热1 min时，DNA质量浓度下降约1／3，说明部分GM大豆的DNA结构发生了降解。微波加热2 min内，GM大豆DNA浓度的下降趋势与Vijayakumar等［17］的研究结果相同。而从提取的DNA中可以扩增出1 512、807、408、206 bp的外源 CP4-EPSPS基因的片段。当微波处理3 min及以上时，已检测不到≥100 bp的外源基因片段。表明GM大豆的外源基因已经严重变性降解甚至焦化。

3.2 超高压对抗草甘膦转基因大豆外源基因的影响

超高压加工是在低温、室温和温和加热的条件下采用100～900 MPa压力对食品进行杀菌和杀灭有害微生物而很少影响食品新鲜度、质构、色泽风味的物理加工方法［18］。通常认为，在高压作用下，形成高分子立体结构的氢键、离子键等非共价键发生变化，而共价键不发生变化，即小分子物质不被破坏。曾庆梅等［19］研究了超高压参数对大肠杆菌DH5质粒DNA的影响，结果表明，在25℃经300、400、500 MPa压力处理15 min后，样品吸光度与未经高压处理样品相比吸光度上升，琼脂糖凝胶电泳结果显示大肠杆菌 DH5质粒 DNA经超高压（300、400、500 MPa）处理后条带增多，表明超高压处理影响了质粒DNA的结构。而苏丹等［14］就超高压处理对大豆分离蛋白结构影响的研究表明，400～600 MPa下处理20 min，大豆蛋白巯基含量和表面疏水性都明显增加，大豆蛋白的亚基组成发生明显变化，可使蛋白质由较大的颗粒解聚成较小的颗粒。本研究结果显示，以500 MPa压力处理样品10 min后，样品的基因组质量浓度比未处理组降低55.7%，但仍能检出1 512、807、408、206 bp的外源基因片段，仅1 512 bp片段的浓度有明显降低。说明超高压处理不能有效降解抗草甘膦转基因大豆的外源基因DNA。

4 结论

4.1 本试验条件下，微波处理≥3 min时，能有效降解抗草甘膦转基因大豆的外源基因CP4-EPSPS，样品中已经检测不出100 bp以上的CP4-EPSPS基因片段。

4.2 经100～500 MPa的超高压处理10 min，不能有效降解抗草甘膦转基因大豆的外源基因CP4-EPSPS。

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The Effect of Microwave and Ultra-High Pressure Parameters on the Degradation of Exogenous DNA of GM Soybean

Wang Weiguo Zhu Zhanqi Wu Xingquan
（Bio-engineering College，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

The purpose of this experiment is to study the effects of microwave and ultra-high pressure parameters on the degradation of exogenous DNA CP4-EPSPS of GM soybean.The GM soybean samples were treated for 1，2，3，4 and 5 min separately by microwave，or treated by 100，200，300，400 and 500 MPa pressure respectively for 10 min.Then the samples both treated and untreated were tested for the degradation of exogenous gene of GM soybean by qualitative PCR detection method.The results showed that Roundup Ready soybean genome concentration decreased with the increasing of microwave treating time.When the treating time reached 3 min and 5 min，the genome concentration reduced to 9 ng／μL and 0 ng／μL.PCR test results showed that exogenous gene has been degraded to smaller than 100 bp；For the ultra-high pressure treatment，the genome concentration decreased with the increase of pressure.After 500 MPa treatment，the concentration of the genome reduced to 40 ng／μL，fragments of 1 512 bp could still be detected out.Comparing with the ultra-high pressure treatment，microwave treatment was more effective to the degradation of exogenous gene of GM soybean.

GM soybean，CP4-EPSPS，microwave，ultra-high pressure，degradation

S816.9

A

1003-0174（2015）02-0020-06

“十二五”国家科技支撑计划（2011BAD26B0401）

2013-09-20

王卫国，男，1956年出生，教授，饲料加工新技术