胆囊癌中趋化因子CXCL12和CXCR4的表达

沈 剑，王伯良，严琦敏，郭学刚(第四军医大学唐都医院急诊科，西安 7008;解放军第医院肝胆外科;第四军医大学西京医院消化病医院6科;通讯作者，E-mail:xuct00@qq．com)

原发性胆囊癌(primary gallbladder cancer)作为原发于胆囊的恶性肿瘤，临床相对少见，但恶性程度高，预后极差，即使手术治疗其5年生存率也只有30%［1-3］。对胆囊癌发生发展过程中的生物学行为研究较少，其本质还未被充分认识［2-4］。趋化因子CXCL12和它的自身受体CXCR4形成CXCL12-CXCR4生物学轴(CXCL12-CXCR4 biological axis)在肺癌、胆囊癌、结肠癌等的发生发展，以及浸润和转移过程中发挥着重要作用［5-7］，但这一生物轴在胆囊癌中作用机制还不明确［8］。我们通过测定胆囊癌组织中CXCL12和CXCR4表达，并探讨其临床意义。

1 对象和方法

1．1 对象

选择2010-01～2014-12第四军医大学唐都医院和解放军第323医院手术切除病理证实的原发性胆囊癌标本132例，男性74例，女性58例，年龄35-76 岁，平均(56．7 ±16．6)岁，包括淋巴结转移46例和无淋巴转移86例。全部患者术前均未进行抗肿瘤治疗(放化疗、免疫治疗等)。胆囊癌Nevin分期为Ⅰ-Ⅲ期46例，Ⅳ-Ⅴ期86例;组织病理学为腺癌102例，其他30例，其中高分化48例，中分化30例，低分化54例。对照组标本选择正常胆囊24例，男性14例，女性10例，年龄45-66岁，平均(52．7 ±8．6)岁。

1．2 试剂

检测所用试剂包括兔抗人CXCL12单克隆抗体(RD公司，美国)，鼠抗人CXCR4单克隆抗体(Abcam公司)，免疫组织化学ElivisionTMPlus检测试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司。所有操作均按照试剂盒说明并结合实际进行。

1．3 方法

用免疫组织化学确定胆囊癌和正常胆囊标本中CXCL12和CXCR4表达。①胆囊癌标本和正常标本按要求进行切片脱蜡和水化;②在pH6．0枸橼酸盐缓冲液中加热修复15 min，温度在95-98℃，然后在过氧化氢溶液(0．3%)室温下孵育10 min;③加入一抗(CXCL12稀释为4 μg/ml，CXCR4稀释为5 μg/ml)，孵育过夜;④滴加聚合物增强剂，室温下孵育20 min;⑤滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30 min，再滴加新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)溶液显色，苏木素复染，盐酸酒精分化;⑥用已知阳性切片作对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作空白对照，用正常胆囊组织标本作阴性对照。

1．4 结果判定

胆囊组织细胞的胞质和胞膜内出现棕黄色着色颗粒为CXCL12和CXCR4阳性细胞，评分包括阳性肿瘤细胞百分数和染色深浅两方面。判断结果必须结合SP法染色强度(阳性)和阳性细胞百分比。①染色强度:阴性(-)为不着色计0分，弱阳性(+/-)为淡棕黄色计1分，弱阳性和强阳性之间(+)计2分，深棕黄色为强阳性(++)计3分。②阳性细胞百分比计分方法:＜5%为0分，5%-30%为1分，30%-60%为2分，＞60%为3分。③结果判断:染色强度和阳性细胞分值之和为最后分值，0-2分为阴性(-)，3-6分为阳性(+)。

1．5 统计学分析

采用SPSS 13．0统计软件，计数资料分析用χ2检验，相关性分析用Spearman分析。P＜0．05认为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 CXCL12和CXCR4蛋白表达

在胆囊癌细胞质中CXCL12阳性染色，其染色颗粒表现为浅黄色或棕黄色;CXCR4蛋白表达也位于胆囊癌细胞质中，其表达呈棕黄色(见图1)。在胆囊癌组织中CXCL12和CXCR4表达阳性表达率分别为69．7%和62．1%，分别高于正常胆囊表达分别为16．7%(χ2=12．284，P ＜0．01)和 8．3%(χ2=13．642，P＜0．01)，胆囊癌中两者表达明显高于正常胆囊(P均＜0．01)。此外，CXCL12 和 CXCR4 表达与Nevin分期、淋巴结转移密切相关(P＜0．05，见表1)。

图1 胆囊癌淋巴结转移时CXCL12和CXCR4蛋白表达(SP，×100)Figure 1 Expression of CXCL12 and CXCR4 in gallbladder carcinoma patients with lymph node metastasis(SP，×100)

2．2 CXCL12与CXCR4蛋白表达的相关性

CXCL12与CXCR4表达通过Spearman相关性分析，结果表明两者存在一定相关性(r=0．438，P＜0．05)。高分化48例，中分化30例，低分化54例。

3 讨论

趋化因子蛋白家族中的CXCL12是一个小分子细胞因子，也称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，包括SDF-1α/CXCL12a和 SDF-1β/CXCL12b。趋化因子的结构特殊，主要由4个半胱氨酸残基组成两对双硫键构成，这种结构对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育中起重要作用［5-7］，在免疫系统发育过程发挥作用是由于CXCL12对淋巴细胞具有强烈趋化作用引起。CXCL12在脑、心、肺、肝、肾等组织中都有表达［3-5］，也对这些部位均具有调控作用［2，8］。CXCL12通过CXCR4受体活化细胞内信号传递使膜受体信号向细胞内转导，这一过程可以通过PI3K/AKT(PI3K/AKT通路实现的，这一过程是调节细胞凋亡、自噬和发生发展，以及一些重要基因表达，从而调节细胞周期蛋白变化和细胞增殖［8-11］。

CXCL12和CXCR4在肿瘤组织中的表达已受到广泛重视，它们所构成的耦联分子影响肿瘤细胞生长过程、迁移和增殖，从而对肿瘤消长发挥着重要作用［13-16］。CXCL12在卵巢癌、胰腺癌、脑胶质瘤等肿瘤中表达已有报道［4］，同时也可以在肿瘤易发生转移的组织(肺、肝、骨骼等)中也有表达［15-18］。胆囊癌病变程度或分期和淋巴结转移都可导致CXCL12蛋白表达的变化，肿瘤晚期和淋巴结转移时CXCL12表达升高，表明CXCL12在参与胆囊癌发展过程有重要作用，而CXCR4则在肿瘤组织中的表达差异导致个体肿瘤的不同发展方向［4-6］，本研究也支持这一结果。

表1 CXCL12和CXCR4在胆囊癌中的阳性表达 例(%)Table 1 Expression of CXCL12 and CXCR4 in gallbladder carcinoma cases(%)

研究表明［19-21］，CXCL12和 CXCR4对肿瘤的作用可以通过丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶信号途径影响癌细胞迁移，也可以通过自分泌和旁分泌影响癌细胞生长［10-12，22-24］。Schioppa 等［13］则认为缺氧诱导因子-1α、核转录因子以及肿瘤抑制蛋白可能上调CXCL12及CXCR4的表达水平，从而影响肿瘤的发生发展。肿瘤异常增殖以及过度生长均可使瘤内出现严重缺氧，此时可以通过调节代谢克服氧气供给和改善营养物质，同时发生某些基因表达改变影响肿瘤细胞的生长和转移［14，15］，研究表明肿瘤过程中局部缺氧引起CXCR4表达可能是抑制肿瘤细胞凋亡从而促进肿瘤的增生和转移［15，16，24-26］。

我们研究表明，CXCL12和CXCR4在原发性胆囊癌中有明显表达，且与Nevin分期、淋巴结转移密切相关，提示测定它们对原发性胆囊癌的诊断可能具有一定临床意义。

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