短柄五加果实多糖对果蝇非特异性刺激下生存函数的影响

李东波，周天林，肖朝霞，张博

（陇东学院甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室，甘肃庆阳745000）

短柄五加果实多糖对果蝇非特异性刺激下生存函数的影响

李东波，周天林，肖朝霞，张博

（陇东学院甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室，甘肃庆阳745000）

目的研究短柄五加果实多糖对果蝇非特异性刺激（冷、热和重金属）下生存函数的影响。方法用短柄五加果实多糖（0.00%、0.01%、0.05%、0.20%、1.00%）饲喂果蝇，然后分别置于冷（3℃）、热（35℃）和重金属（Cd、Cu、Pb）胁迫下，统计其不同时段死亡数。用Kaplan-meier模型建立对数生存函数并求得果蝇的平均生存时间、中位生存时间和最长生存时间。结果0.05%的短柄五加果实多糖使果蝇在高温胁迫下生存能力提高27.3%、在低温胁迫下生存能力提高18.6%，在镉胁迫环境下生存能力提高91.7%，且不受果蝇身体素质影响。结论短柄五加果实多糖可能具有提高动物冷、热适应能力及解重金属毒害的作用，为短柄五加进一步的药物和功能食品开发提供理论依据。

短柄五加多糖；果蝇；非特异性刺激；生存函数

短柄五加（Acanthopanax brachypus）是五加科五加属药食两用植物。世界上仅我国西北部黄土高原区有少量分布，属我国特有濒危珍稀灌木[1]。五加科植物多具有重要的药理活性，《本草纲目》记载“宁要五加一握，不要金玉满车”。短柄五加根及茎皮具有益气健脾、宁心安神、开郁活血等功效[2]。其根、茎等常用于治疗神经衰弱、男子性功能障碍、妇女更年期综合征等疾病[3]。目前对短柄五加的研究主要集中在根茎化学成分[4，5]、生殖生物学和生态学方面[6]，而对其有效成分的药理学研究相对不足。

五加科植物多糖常具有重要而明显的生物活性，如抗衰老、抗肿瘤、增强对非特异性刺激的耐受性、免疫调节等，且低毒甚至无毒，是目前药学研究的热门之一[7]。通过文献查新可知，由于短柄五加珍贵稀少，其果实多糖药理活性目前尚未见相关报道。

果蝇是目前被研究透彻的模式生物之一，将其作为疾病模型进行药理活性研究和新药开发已被国际认可[8]。目前，果蝇已广泛用于药物抗衰老[7]、抗非特异性刺激等方面[9，10]。本研究以黑腹果蝇为动物模型，研究短柄五加果实多糖对果蝇非特异性刺激下（高、低温和重金属）生存函数的影响，旨在为高效、合理开发短柄五加和新药研发提供科学依据及数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

短柄五加果实多糖（本实验室自制）、w1118野生型果蝇（Drosophila melanogaster）（陇东学院生命科学与技术学院遗传学教研室提供）、乙酸铅、氧化镉、氯化铜、丙酸、乙醚、玉米粉、酵母膏、琼脂、食品级白砂糖。

1.2 仪器与设备

MGC-300A型智能光照培养箱（北京中科浩宇科技发展有限公司），DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），BS-223S电子精密天平（北京塞多利斯仪器系统有限公司）。

1.3 果蝇实验

1.3.1 基本培养基和多糖培养基配制基本培养基采用琼脂玉米培养基[11]：玉米粉28 g、白砂糖22 g、水150 ml，混匀加热至糊状；琼脂2.5 g加入100 ml水中，加热溶解，倒入玉米糊中，搅匀冷却至室温，加酵母膏2.5 g，丙酸2 ml，搅拌混匀，分装至果蝇管中备用。多糖培养基：在基本培养基中添加短柄五加果实多糖溶液，制成终浓度为0.01%、0.05%、0.20%、1.00%的4个多糖培养基[12]。

1.3.2 果蝇饲养w1118野生型果蝇，回交6代，以确保遗传背景一致。在温度25℃，相对湿度65%，光周期为12 h/d条件下培养果蝇，收集12 h内羽化果蝇，乙醚麻醉，分雌雄，收集处女蝇以备实验。

1.3.3 短柄五加果实多糖对高温胁迫下果蝇死亡率的影响将处女蝇分别在基本培养基（0.00%）及多糖培养基（0.01%、0.05%、0.20%、1.00%）中培养7d，然后将不同处理组果蝇转入相应含1%琼脂的果蝇管中，在温度35℃，相对湿度65%，光周期为12 h/d的恒定条件下培养[13]，每隔12 h统计一次，直至果蝇全部死亡。每处理组50只果蝇（每管10只，共5个平行管），实验重复3次。

1.3.4 短柄五加果实多糖对低温胁迫下果蝇死亡率的影响将处女蝇分别在基本培养基（0.00%）及多糖培养基（0.01%、0．05%、0．20%、1．00%）中培养7 d，然后将不同处理组果蝇转入相应含1%琼脂的果蝇管中，在温度3℃（经多次预实验确定），相对湿度65%，光周期为12 h/d的恒定条件下培养，每隔12 h统计一次，直至果蝇全部死亡。每处理组50只果蝇（每管10只，共5个平行管），实验重复3次。

1.3.5 短柄五加果实多糖对重金属胁迫下果蝇存活率的影响通过半数致死率实验求得重金属对果蝇的半致死浓度（氧化镉0．5%、氯化铜0．5%、乙酸铅5%）。将处女蝇分别在多糖培养基（0．00%、0．05%）中培养7 d，分别转入基本培养基和重金属培养基（镉、铜、铅）中，在温度25℃，相对湿度65%，光周期为12 h/d的恒定条件下培养，每隔12 h统计一次，直至果蝇全部死亡。每处理组50只果蝇（每管10只，共5个平行管），实验重复3次。

1.4 数据统计

用SPSS 19．0软件进行分析和作图，用Kaplan－meier模型做数据统计分析。

2 实验结果

2.1 短柄五加果实多糖对高温胁迫下果蝇生存函数的影响（见图1）

图1 短柄五加果实多糖对高温胁迫下果蝇生存函数的影响

由图1可知：高温胁迫下果蝇平均生存时间分别为55 h（0．00%）、60 h（0．01%）、70 h（0．05%）、56 h（0．20%）和63 h（1．00%）。经Log－Rank比较分析可知，0．05%组与0．00%组生存时间差异显著（P＜0．05），说明浓度为0．05%的短柄五加果实多糖对果蝇抗高温胁迫效果最好（比0．00%组提高27．3%）。

高温胁迫下果蝇中位生存时间分别为48 h（0．00%）、60 h（0．01%）、60 h（0．05%）、60 h（0．20%）和48 h（1．00%），说明0．01%～0．20%的短柄五加果实多糖对体弱果蝇的抗低温胁迫效果均好，1．00%的短柄五加果实多糖效果不明显。最长生存时间分别为120 h（0．00%）、132 h（0．01%）、156 h（0．05%）、120 h（0．20%）和132 h（1．00%），说明0．05%的短柄五加果实多糖对强壮果蝇的抗高温胁迫效果也最好。

2.2 短柄五加果实多糖对低温胁迫下果蝇生存函数的影响（见图2）

由图2可知：低温胁迫下果蝇平均生存时间分别为102 h（0．00%）、115 h（0．01%）、121 h（0．05%）、105 h（0．20%）和103 h（1．00%）。经Log－Rank比较分析可知，0．05%组和0．00%组结果差异显著（P＞0．05），说明0．05%的短柄五加果实多糖对果蝇抗低温胁迫效果最好（比0．00%组提高18．6%）。

低温胁迫下果蝇中位生存时间分别为96 h（0．00%）、108 h（0．01%）、120 h（0．05%）、108 h（0．20%）和96 h（1．00%），最长生存时间分别为156 h（0．00%）、156 h（0．01%）、170 h（0．05%）、156 h（0．20%）和156 h（1．00%），说明0．05%的短柄五加果实多糖对体弱和强壮果蝇的抗低温胁迫效果最好。

图2 短柄五加果实多糖对低温胁迫下果蝇生存函数的影响

2.3 0.5%氧化镉胁迫下0.05%短柄五加果实多糖对果蝇生存函数的影响（见图3）

图3 0．5%氧化镉胁迫下短柄五加果实多糖对果蝇生存函数的影响

由图3可知：果蝇平均生存时间分别为36 h（0．00%）、69 h（0．05%）。经Log－Rank比较分析可知，0．05%组和0．00%组差异显著（P＜0．01），说明0．05%的短柄五加果实多糖对果蝇抗氧化镉胁迫效果好（比0．00%组提高91．7%）。

0．5%氧化镉胁迫下果蝇中位生存时间分别为36 h（0．00%）、60 h（0．05%），最长生存时间分别为60 h（0．00%）、108 h（0．05%），说明0．05%的短柄五加果实多糖对体弱和强壮果蝇的抗氧化镉胁迫效果也好。

2.4 0.5%氯化铜胁迫下0.05%短柄五加果实多糖对果蝇生存函数的影响（见图4）

由图4可知：0．5%氯化铜胁迫下果蝇平均生存时间分别为68 h（0．00%）、59 h（0．05%）。经Log－Rank比较分析可知，0．05%组和0．00%组差异无显著性（P＞0．05），说明0．05%的短柄五加果实多糖对果蝇抗氯化铜胁迫效果不显著。

图4 0．5%氯化铜胁迫下短柄五加果实多糖对果蝇死亡函数的影响

0．5%氯化铜胁迫下果蝇中位生存时间分别为84 h（0．00%）、60 h（0．05%），最长生存时间分别为84 h（0．00%）、84 h（0．05%），说明0．05%的短柄五加果实多糖对体弱和强壮果蝇的抗氯化铜胁迫效果不显著。

2.5 5%乙酸铅胁迫下0.05%短柄五加果实多糖对果蝇生存函数的影响（见图5）

图5 5%乙酸铅胁迫下短柄五加果实多糖对果蝇生存函数的影响

由图5可知：5%乙酸铅胁迫下果蝇平均生存时间分别为62 h（0．00%）、72 h（0．05%）。经Log－Rank比较分析可知，0．05%组和0．00%组差异无显著性（P＞0．05），说明0．05%的短柄五加果实多糖对果蝇抗乙酸铅胁迫效果不显著。

5%乙酸铅胁迫下果蝇中位生存时间分别为60 h（0．00%）、60 h（0．05%），最长生存时间分别为84 h（0．00%）、84 h（0．05%），说明0．05%的短柄五加果实多糖对体弱和强壮果蝇的抗乙酸铅胁迫效果不显著。

3 讨论

药物筛选是一个成本高、时间长的艰苦工作，用小鼠或大鼠做药物模型，常由于人道主义问题、成本高和饲养管理不便受到限制。果蝇遗传背景清晰，饲养简便，成本低，繁殖快，不存在伦理问题，而且其在生长发育、生理功能、代谢途径等方面与哺乳动物基本相似，超过60%的人类疾病基因在果蝇中具有同源基因，这些优势使其成为很好的代替人的动物模型。郭俊生等[13]证明果蝇可以用做研究提高热适应能力物质的动物模型，黄云鹏等[10]认为果蝇可以作为研究金属元素和疾病之间关系的动物模型。

果蝇生存试验可以灵敏地反映环境、药物等因素对寿命的影响，其中，平均生存时间是最重要的指标，为综合药效的反映；中位生存时间反映药物对体弱果蝇的延寿效果；最长生存时间反映药物对强壮果蝇的延寿效果。本研究表明，0．05%的短柄五加果实多糖能增强果蝇耐高、低温能力和抗重金属镉的毒害，且不受身体素质的影响。这些结果提示短柄五加果实多糖可能具有提高动物冷、热适应能力及解重金属毒害的作用，为短柄五加的药物开发提供又一方向。

[1]岳春雷，江洪，魏伟，等．短柄五加濒危趋势和致濒因素的初步分析[J]．应用与环境生物学报，2003，9（1）：24－27．

[2]胡浩斌，郑旭东，胡怀生．短柄五加茎皮的HPLC指纹图谱研究[J]．药物分析杂志，2014，34（2）：355－359．

[3]李兴运，张盛桥，李晓珍，等．短柄五加冲剂治疗妇女更年期综合征双盲试验研究[J]．中药药理与临床，1989，5（1）：45－47．

[4]李东波，张博，刘灵霞，等．短柄五加果实中黄酮提取工艺优化研究[J]．陇东学院学报，2013（5）：42－45．

[5]胡浩斌．短柄五加的化学成分及生物活性研究[D}．西安：西北大学，2010．

[6]郑万钧．中国木本植物志[M]．北京：中国林业出版社，1985．

[7]Lee K S，Lee B S，Semnani S，et al．Curcumin extends life span，improves health span，and modulates the expression of age－associated aging genes in drosophila melanogaster[J]．Rejuvenation research，2010，13（5）：561－571．

[8]Pandey U B，Nichols C D．Human disease models in drosophila melanogaster and the role of the fly intherapeutic drug discovery[J]．Pharmacological reviews，2011（63）：411－436．

[9]李向辉，郭俊生，赵法伋，等．强化苦丁茶提高热耐受能力的观察[J]．解放军预防医学杂志，2001，19（2）：92－94．

[10]黄云鹏，周兵．利用黑腹果蝇研究微量金属元素代谢[J]．生命科学，2012，24（8）：927－938．

[11]张会宜．果蝇饲料玉米粉培养基配方的改进[J]．唐山师范学院学报，2005（5）：46－47．

[12]徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学[M]．北京：人民卫生出版社，2002．

[13]郭俊生，赵法伋，王枫，等．热暴露对果蝇寿命及热应激蛋白（Hsp70）含量的影响[J]．解放军预防医学杂志，1998，16（4）：247－249．

G424.31

B

1671-1246（2015）05-0102-03

注：本文系甘肃省教育厅项目（1010-08）；庆阳市重大科技支撑项目（1003NKCM020）；陇东学院科研基金项目（lyzk1101）