加巴喷丁对大鼠坐骨神经慢性压迫损伤DRG中TRPV1的影响

（大连医科大学附属第一医院 1.麻醉科；2.急诊科，大连 116011）

加巴喷丁对大鼠坐骨神经慢性压迫损伤DRG中TRPV1的影响

阎妮1，栾永1，李润玖2

（大连医科大学附属第一医院 1.麻醉科；2.急诊科，大连 116011）

目的研究加巴喷丁对坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）大鼠DRG中TRPV1的影响。方法使用SD雄性大鼠建立CCI模型，随机分为3组：对照组，CCI组，CCI+GBP组。使用行为学检测机械性痛和热痛。术后第8天，搜集DRG，用RT-PCR和Western blot检测DRG中TRVP1的表达情况。结果CCI手术后DRG中TRPV1基因的mRNA表达显著增加，GBP能够减少CCI后DRG的TRPV1基因的mRNA表达。结论在CCI手术后，DRG中TRPV1基因的表达升高，使用GBP后，其表达降低。

神经痛；加巴喷丁；坐骨神经慢性压迫损伤；大鼠；TRPV1

神经病理性疼痛（neuropathic pain）是临床常见的一种慢性疼痛，具有痛觉过敏、痛觉异常和自发性疼痛的特点。神经病理性疼痛的病因比较复杂，包括中枢和外周神经系统的损伤、感染炎症、异物压迫、糖尿病等都可能引起患者产生神经病理性疼痛的症状。神经病理性疼痛的患者长时间忍受折磨，但由于目前该病的发病机制仍不清楚，没有合适的治疗方法［1］。神经病理性疼痛不单影响患者个人的生活，还会影响到患者的家庭、工作。为此，找到合适的治疗药物缓解疼痛尤其重要。

瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptorpotential vanilloid 1，TRPV1），是指“瞬态感受器电位阳离子通道，子类Ⅴ，成员1”（transient receptor potential cation channel，subfamilyⅤ，member 1），该通道是由TRPV1基因所编码的蛋白质［2］。该通道被发现存在于中枢神经系统及外周神经系统上，并且涉及痛觉的传递和调制，以及整合各种疼痛信息［3］。

目前，加巴喷丁治疗神经病理性疼痛的疗效逐渐被临床认可，越来越成为科研的焦点。大量的临床试验已证实加巴喷丁可以缓解患者的部分疼痛症状［4］，但是内在作用机制仍有待研究。本研究通过坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constriction injury，CCI）大鼠模型，证实加巴喷丁能有效抑制神经病理性疼痛。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康的SD雄性大鼠18只，体质量为190～210 g，购自大连医科大学实验动物中心，饲养环境有通风系统，温度控制在23℃，灯光控制明暗各12 h。 将18只SD大鼠随机分为3组（每组n= 6）：对照组；手术组，CCI；治疗组，CCI+GBP 100 mg/kg加巴喷丁组。

1.2 实验设备与试剂

Von Frey丝，不锈钢丝网垫（0.5 cm×0.5 cm），有机玻璃隔板20 cm×10 cm×15 cm，手术器械，戊巴比妥钠，加巴喷丁。

1.3 大鼠CCI模型

根据Bennet-xie模型制作大鼠CCI模型，腹腔注射麻醉，给大鼠备皮，用75%乙醇消毒，铺消毒巾，用手术刀在大鼠左侧大腿中点切开皮肤，经股二头肌的缝隙钝性分离，暴露出坐骨神经，小心将坐骨神经与周围组织分开。在坐骨神经主干远端7 mm处，用4号羊肠线将坐骨神经结扎4道，每道之间间隔1 mm。

1.4 行为学检测

实验大鼠手术后，观察其步态和后肢的运动状态，观察大鼠是否有肢体瘫痪和运动障碍的问题。

1.4.1 Von-frey检测大鼠对机械性刺激的反应：测试大鼠行为时，保证环境不受外界干扰，将待检测大鼠放置在有机玻璃挡板中，下面放不锈钢网。大鼠适应环境1 h后，使用Von-frey丝扎大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，每次间隔20 s。大鼠出现抬足、缩足、甩足、舔足等反应。将3次结果取平均值作为机械缩足反射阈值（mechanical withdrwal threshold，MWT）。各组大鼠在手术前测定左足基础机械痛域，手术后第4天开始，每天测量机械性痛域，测定时间固定为上午10时到11时。

1.4.2 检测大鼠对热刺激的反应：在安静的环境，将热板测痛仪预热到55℃，然后将大鼠放置于观察箱中，检测大鼠从后足接触热板到缩足反射的潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。检测3次，取平均值，作为热痛过敏的阈值，最高阈值设定为20 s，超过20 s后正常大鼠可以引起疼痛反应。

1.5 RT-PCR检测大鼠DRG中TRPV1的mRNA水平

选取CCI手术后第8天处死大鼠，搜集腰3，腰4，腰5的手术侧DRG，应用RT-PCR的方法研究GBP对疼痛相关基因TRPV1的影响。使用Primer Premier5.0软件设计引物，大连Takara公司合成。TRPV1 Forward：5′-GGTGGACGAGGTAAACTGGA-3′，Reverse 5′-GCTGGGTGGCATGTCTATCT-3′，131 bp；GAPDH，Forward：5′-CCGAGGGCCCACTAA AGG-3′，Reverse：5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGA CAA-3′，120 bp。逆转录和PCR反应严格按照试剂盒操作进行。逆转录具体操作：1 μL样品RNA，1 μ L随机引物Random Hexamer（50 pmol/μL），2 μL 5× Reverse transcriptase buffer，6 μL RNase-free H2O，在65℃变性5 min后迅速置于冰浴中。再加入2 μL 5×Reverse transcriptase buffer，4 μ L dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL RNase抑制剂（200 U/μL），2 μL DTT（100 mmol/L），1 μL M-MLV Reverse Transcriptase（50 U/μL），总体积为20 μL，于37℃温育1 h，反应结束后在95℃加热5 min以灭活逆转录酶，4℃冷却，产物于-20℃保存备用。

实时定量PCR反应体系：sybr green PCR master mix（Applied Biosystems by life technologies）12.5 μL、正义与反义PCR引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL、模板mRNA2 μL。反应条件：95℃10 s，95℃5 s，60℃45 s，共40个循环，反应结束后，自动计算定量结果。

1.6 统计学分析

用SPSS 13.0统计软件进行分析，实验结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疼痛行为学结果

CCI组与CCI+GBP组大鼠术后健康状态好，能够正常饮食，喝水，大鼠体质量没有明显降低，手术伤口愈合良好，无感染。这2组大鼠手术后第3天基本恢复正常。术后1周，大鼠手术侧下肢长时间悬空或不敢触地负重，步态表现为跛行，站立时以对侧正常后肢负重为主，无肢体瘫痪。

2.2 CCI大鼠机械性刺激痛阈的变化及GBP对其变化的影响

各组手术前左、右后足机械性痛阈无统计学显著性差异（P＞0.05）。CCI组自术后第4天开始出现患侧机械性痛阈显著下降，与对照组对应时间点相比有显著性差异（P＜0.01）。CCI+GBP组在手术后4～8 d，出现机械性痛阈上升，与CCI组相比较有显著性差异（P＜0.01），手术后第10天，其机械性痛阈与CCI组相比较没有显著性差异（P＞0.05）。见表1、2，图1。

2.3大鼠DRG中TRPV1mRNA表达情况

CCI手术后，CCI组与对照组相比较，DRG中TRPV1的mRNA表达升高，有统计学差异（P＜0.05）；CCI+GBP组与CCI组比较，DRG中TRPV1的mRNA表达降低，有统计学差异（P＜0.05）。见图2。

表1 大鼠CCI手术侧后足机械性痛阈的变化（g）Tab.1 Changes of MWT of hind paw of rats at operation side after CCI（g）

表2 大鼠CCI非手术侧后足机械性痛阈（MWT）的变化（g）Tab.2 Changes of MWT of hind paw of rats at non-operation side after CCI（g）

图1 大鼠CCI手术侧后足机械性痛阈的变化Fig.1 Changes of MWT of hind paw of rats at operation side after CCI

图2 大鼠DRG中TRPV1mRNA表达的变化Fig.2 Changes of TRPV1mRNA expression in DRG of rats

2.4 大鼠DRG中TRPV1的蛋白表达情况

CCI手术后，CCI组与对照组相比较，DRG中 TRPV1的蛋白表达升高，有统计学差异（P＜0.05）；CCI+GBP组与CCI组比较，DRG中TRPV1的蛋白表达降低，有统计学差异（P＜0.05）。见图3。

图3 大鼠DRG中TRPV1的蛋白表达变化Fig.3 Changes of TRPV1 protein expression in DRG of rats

3 讨论

TRPV1受体在外周神经中，主要分布于脊髓背根神经节和三叉神经节中的初级感觉神经元，特别是中小型神经元。TRPV1通道与配体结合后激活膜离子通道，引起钙离子跨膜流动，使细胞内钙离子浓度改变，激活一系列细胞内信号，参与多种细胞内病理生理过程。神经损伤后，会产生炎性因子，进而激活TRPV1受体。有研究证明TRPV1受体与神经病理性疼痛的形成相关。朱琳等［5］的研究发现，TRPV1受体被辣椒素激活后，会产生神经兴奋，随后导致TRPV1受体发生脱敏反应。在临床应用当中，8%浓度的辣椒素透皮贴剂可以缓解带状疱疹后的神经疼痛［6］。TRPV1受体被激活还会引起降钙素基因相关肽的释放，从而导致血管扩张和血浆外渗，这也是产生神经性炎症的重要原因［7］。使用辣椒素可以缓解弗氏佐剂引起的炎症痛［8］。近期有报道，辣椒辣素坐骨神经周围给药可以减轻神经松弛结扎所引起的痛觉过敏［9］。许先成等［10］研究发现，在糖尿病大鼠神经病理性疼痛的模型中，大鼠背根神经节中TRPV1的表达增高与疼痛的形成和维持有关。最近的一份研究报道证实，TRPV敲除的小鼠，由外周神经损伤引起的机械痛敏比野生型小鼠轻，并且其机制与脊髓背角中间神经元的抑制信号的减弱有关，为TRPV在神经病理性疼痛中的作用提供了更为直接的证据［11］。本研究通过构建大鼠CCI的动物模型，研究加巴喷丁对DRG中TRPV1的变化情况。

通过行为学实验，证明大鼠CCI模型建立成功，并且在CCI模型的大鼠注射加巴喷丁，可以改善大鼠的疼痛程度。利用RT-PCR技术检测DRG中TRPV1的基因表达，结果发现CCI手术后TRPV1表达明显升高，注射加巴喷丁后，能够降低由CCI手术引起的TRPV1表达增高的情况。利用Western blot技术检测DRG中TRPV1的蛋白表达情况，结果表明与mRNA水平的表达一致，CCI后TRPV1蛋白表达增高，加巴喷丁能够降低CCI手术引起的TRPV1蛋白表达增高。

外周神经损伤引起的神经病理性疼痛，表现为痛觉过敏、异常痛敏、感觉缺失和自发性疼痛。外周神经损伤后会有离子通道表达的改变，这种改变可能是受损伤神经纤维兴奋性增高和放电的重要原因。有文献报道，结扎周围神经可以引起神经源性的疼痛，从而导致DRG中TRPV1的表达增加［12］。

通过我们的研究发现，加巴喷丁能够缓解CCI的行为学表现，并降低TRPV1在基因与蛋白水平的表达，提示我们，加巴喷丁有可能通过TRPV1通道发挥缓解疼痛的作用。TRPV1有可能是加巴喷丁的作用位点。

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［5］朱琳，章鹏宇，王景杰，等.小胶质细胞在肠易激综合征IBS内脏高敏感化作用的展望［J］.山西医科大学学报，2011，42（5）：434-437.

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（编辑裘孝琦）

The Effectof Gabapentin on TRPV1 in RatDRGafter CCI

YAN Ni1，LUANYong1，LIRun-jiu2
（1.Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China；2.Emergency Department，The First Affiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo study the effect of Gabapentin（GBP）on the transient receptor potential vanilloid l（TRPV1）in dorsal root ganglion（DRG）of rats with chronic constriction injury（CCI）.MethodsSD male rats were used to establish CCI model and randomly divided into 3 groups，the controlgroup，the CCIgroup，and the CCI+GBPgroup.Mechanicalallodynia and thermalhyperalgesia were measured to evaluate the establishment of CCI model and the analgesic effect of GBP.At the postoperative 8 days，all rats were sacrificed and dorsal root ganglions were collected for further RT-PCR and Western-blotting analysis to detect expression of TRVP1 in DRG.ResultsThe mRNA and protein expression of TRPV1 were both significantly increased in DRG after CCI operation and GBP could decrease mRNA expression of TRPV1 gene in DRG after CCI.ConclusionThe expression ofTRPV1 was increased in DRGafter CCIoperation which wasdecreased afteradministration ofGBP.

neuralgia；Gabapentin；chronic constriction injury；rat；TRPV1

R745.4

A

0258-4646（2015）03-0234-04

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2013351）

阎妮（1978-），女，主治医师，硕士研究生.

李润玖，E-mail：jizhenicu@163.com

2014-11-30

网络出版时间：