液相色谱-质谱联用法快速测定人血浆中加巴喷丁浓度

2020-10-22 04:27徐凤华孙晓鸣
中国医药科学 2020年15期
关键词:喷丁左乙加巴

徐凤华 孙晓鸣

南京医科大学附属苏州科技城医院药学部,江苏苏州 215153

癫痫是一种慢性疾病,主要是大脑神经元突发性异常放电导致短暂大脑功能障碍[1]。抗癫痫药加巴喷丁(gabapentin,GBP)是γ-氨基丁酸(GABA)的类似物,结构具有多晶型。加巴喷丁可以增加癫痫患者脑中GABA的水平,可抑制癫痫发作。与其他抗癫痫药相比,加巴喷丁副作用较小,几乎没有药物相互作用,能够降低带状疱疹引起的疼痛[2-3]。加巴喷丁的药动学特征存在个体差异,中毒症状与疾病症状不易区分[4],因此监测加巴喷丁血药浓度对保证患者临床用药安全具有重要意义。血浆中加巴喷丁浓度的测定方法主要包括LC-UV法[5-6]、LC-FD[7-10]和LC-MS/MS[11-16]。本研究在文献报道的基础上,建立简便、快捷的LC-MS/MS法测定人血浆中加巴喷丁的浓度。血浆前处理为甲醇沉淀血浆蛋白,定量下限为20.00ng/mL,低于文献报道[5-15],为人血浆中加巴喷丁浓度检测提供手段。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

液相质谱联用仪:三重四极杆串联质谱仪(型号:API4000,美国AB Sciex公司);高效液相色谱仪(型号1260,美国Agilent公司);操作软件工作站为Analyst(版本号为1.6)。天平:(型号XS 105DU,瑞士梅特勒-托利多METTLER TOLEDO公司)。

1.2 对照品与试剂

加巴喷丁对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100655-201302,含量:99.8%);左乙拉西坦对照品(北京博时安泰科技发展有限公司,批号:20150401,含量:99.94%);乙酸铵(AR级,国药集团化学试剂有限公司)。甲醇、乙腈和甲酸(HPLC级,TEDIA公司);水(安徽双鹤药业有限责任公司)。

2 方法

2.1 色谱条件及质谱参数

色谱条件:预柱选用Phenomenex公司Security GuardTMC18柱,规 格 为4.0mm×3.0mm;采 用WATERS公司Symmetry®系列C18色谱柱,规格为3.9×150.0mm,粒径5μm;流动相:水相为5mmoL/L醋酸铵水溶液(含0.3%甲酸);有机相选用乙腈,有机相∶水相=10∶90(v/v),流速为1000μL/min;每个样品运行时间为6.0min,使用切换阀系统,A(排废)和B(质谱系统)两个通道,样品在0.0~2.0min进入通道A,在2.0~6.0min进入通道B;进样量设定为10μL;柱温设定为30℃。

质谱参数:选用APCI大气压力化学电离源,监测模式:正离子电离模式,采用MRM多反应监测;巴喷丁母离子m/z为172.1,子离子m/z为154.1;内标左乙拉西坦母离子m/z为171.1,子离子m/z为126.1,去簇电压(declustering potential,DP)参数分别为30V和45V,碰撞能(collision energy,CE)参数均为22V,扫描时间为200ms。离子源参数:温度(TEM)为400℃,雾化气(N2)为50psi;放电电流为2μA。

2.2 工作液配制

加巴喷丁标准曲线系列贮备液及工作液:使用10mL容量瓶,称量加巴喷丁对照品10.02mg(含量折算后为10.00mg加巴喷丁),用有机溶剂甲醇溶解、稀释并定容,混匀后,溶液为1.000mg/mL的加巴喷丁标准曲线系列贮备液,用有机溶剂甲醇逐步稀释,配制加巴喷丁标准曲线系列工作液,加巴喷丁浓度依次为0.4000、1.000、2.000、6.000、20.00、40.00、80.00和160.0μg/mL。

加巴喷丁质控系列贮备液和工作液:使用10mL容量瓶,称量加巴喷丁对照品10.02mg(含量折算后为10.00mg加巴喷丁),用有机溶剂甲醇溶解、稀释并定容,混匀后,溶液为1.000mg/mL的加巴喷丁质控贮备液,用甲醇逐步稀释,配制质控系列工作液,浓度依次为0.8000、12.00、120μg/mL。同时用甲醇稀释加巴喷丁定量下限工作液,浓度为0.4000μg/mL。

内标(左乙拉西坦)贮备液和工作液:使用10mL容量瓶,称取10.01mg左乙拉西坦对照品(含量折算后为10.00mg左乙拉西坦),用有机溶剂甲醇溶解、稀释并定容,混匀后,溶液为1.000mg/mL的内标(左乙拉西坦)贮备液。以内标(左乙拉西坦)贮备液为源溶液,用有机溶剂甲醇作为稀释溶液,配制12.00μg/mL的内标左乙拉西坦工作液。

2.3 血样样品前处理

于1.5mL规格离心管中,定量吸取200μL血浆样品,加入加巴喷丁标准曲线系列或质控系列工作液10μL和50μL内标(左乙拉西坦)工作液,加入600μL有机溶剂甲醇,用于沉淀血浆种蛋白,涡旋混匀约1min,置于低温高速离心机种,23755×g离心10min(设置温度为4℃)。离心后,定量吸取200μL上清液置进样瓶中,加入水相800μL,涡旋混匀后,置于高效液相色谱仪自动进样器模块(控温,设置温度为10℃)中,液质联用法进样测定加巴喷丁浓度。

3 结果

3.1 特异性实验

分别取加巴喷丁对照品溶液样品、内标(左乙拉西坦)对照品溶液样品、空白血浆按“2.3 血样样品前处理”方法处理后的样品;空白血浆200μL和加巴喷丁对照品溶液(6.000μg/mL)10μL混匀后按“2.3 血样样品前处理”项方法操作后的样品;分别进样测定。结果如下:加巴喷丁和内标(左乙拉西坦)的色谱保留时间分别约为2.50min和3.21min左右,血浆样品中内源性物质不干扰加巴喷丁和内标(左乙拉西坦)色谱峰,不影响加巴喷丁浓度的测定,见图1。

图1 血浆中加巴喷丁的LC-MS/MS图

3.2 标准曲线与最低定量限

定量吸取空白血浆200μL,依次分别加入加巴喷丁标准曲线系列工作液10μL,制备加巴喷丁血浆标准曲线系列样品,各血浆样品中加巴喷丁浓度分别为20.00、50.00、100.0、300.0、1000、2000、4000、8000ng/mL,按“2.3”项方法操作,进样测定,横坐标为加巴喷丁浓度c,纵坐标为血浆中待测物加巴喷丁峰面积As与内标(左乙拉西坦)峰面积Ai比值f,进行线性回归(权重系数为1/C2)。结果显示:血浆中加巴喷丁在浓度20.00~8000ng/mL浓度范围内,线性关系较好,最低定量限LLOQ为20.00ng/mL。

3.3 精密度和准确度

定量吸取200μL空白血浆,分别加入加巴喷丁3种不同浓度的质控系列工作液10μL,工作液浓度依次为0.4000、0.8000、12.00、120.0μg/mL,制备血浆质控系列样品,加巴喷丁浓度分别为20.00、40.00、600.0、6000ng/mL,每个浓度制备6个样品,按“2.3”项方法操作,测定3批,每个分析批需要随行标准曲线,根据标准曲线方程,计算浓度,同时统计批内、批间精密度和相对偏差(进行单因素方差分析),结果如下:低、中、高3种浓度血浆质控样品实测值与理论值偏差(RE)均在±15%范围内,批间和批内相对标准偏差(RSD,relative standard deviation)均小于15%。最低定量限(LLOQ)批内和批间RSD均小于20%,实测值与理论值偏差(RE)均在±20%范围内。

3.4 提取回收率

配制血浆样品,含加巴喷丁浓度依次为40.00、600.0、6000ng/mL,配制方法同“3.3 精密度和准确度”项,同一种浓度6个样品,按“2.3”项方法处理,进样检测得到加巴喷丁和内标左乙拉西坦峰面积。同时,配制空白血浆样品,使用有机溶剂甲醇沉淀蛋白后,直接加入低、中、高3种浓度加巴喷丁质控系列工作液10μL及50μL内标(左乙拉西坦)工作液,混匀,吸取200μL与水相800μL混匀后,测定得到加巴喷丁和内标左乙拉西坦峰面积。计算以上两种处理方式得到的加巴喷丁峰面积比值和内标(左乙拉西坦)峰面积峰面积比值。分别计算血浆中不同浓度加巴喷丁的提取回收率和内标(左乙拉西坦)的提取回收率。结果显示:血浆中加巴喷丁低、中、高三个浓度的提取回收率分别为(102.3±4.4)%(n=6)、(97.5±2.6)%(n=6)和(99.7±2.0)%(n=6);内标左乙拉西坦的提取回收率为(98.7±3.0)%(n=18)。

3.5 基质效应

血浆样品基质:选择来源不同的6个空白血浆样品,各定量吸取200μL至离心管(规格1.5mL)中,加入有机溶剂甲醇600μL,涡旋1min,4℃下,23755×g离心10min,取上清液作为血浆基质,体积为700μL。

对照样品基质:定量吸取200μL纯化水至离心管(规格1.5mL)中,操作方法与制备血浆样品基质相同,得到对照样品基质。

分别定量吸取700μL血浆样品基质或对照样品基质,加入10μL加巴喷丁质控系列工作液和50μL内标左乙拉西坦工作液,混匀。定量吸取上述溶液200μL与800μL水相混匀。上述同一浓度样品平行制备和处理6份(低、中、高3个浓度),并按“2.1 色谱条件及质谱参数”项测定,获加巴喷丁和内标(左乙拉西坦)峰面积。计算同一浓度样品,两种基质(血浆样品基质或对照样品基质)中的峰面积比值。根据比值,计算基质效应。结果显示:血浆中加巴喷丁低、中、高三个浓度的基质效应结果分别为(103.5±4.1)%(n=6)、(97.4±3.6)%(n=6)和(96.7±2.7)%(n=6);内标左乙拉西坦的基质效应为(96.9±4.8)%(n=18)。

3.6 稳定性实验

本研究考察了不同保存条件下,加巴喷丁血浆和贮备液样品的稳定性,结果如下:加巴喷丁血浆样品置于室温(25℃左右)放置6h、置于-30℃冰箱放置40d和-30℃反复冻融(取出融化,再放回-30℃冰箱)3种情况下,血浆样品中加巴喷丁浓度未发生显著变化,即加巴喷丁血浆样品仍稳定。待测样品置于高效液相色谱仪自动进样器模块中48h(控温,设置温度为10℃),加巴喷丁血浆样品经蛋白沉淀离心后,上清液置于室温(25℃左右)放置36h,加巴喷丁血浆次级样品仍稳定。加巴喷丁和内标(左乙拉西坦)贮备液置于室温(25℃左右)下放置12h和置于冷藏(2~8℃)中保存40d情况下,加巴喷丁和内标(左乙拉西坦)贮备液均稳定。

4 讨论

本研究优化了色谱和质谱参数,熊志立等[14]使用0.2%甲酸水溶液作为水相,流动相为甲醇∶0.2%甲酸水溶液(80∶20,v/v),本研究方法建立阶段,借鉴使用此流动相色谱条件,实验结果加巴喷丁色谱峰拖尾,这与文献[11]中提供的图谱相符。醋酸铵有利于改善加巴喷丁和内标左乙拉西坦峰形,相关文献[10,12]亦在流动相中加入了铵盐。液质联用仪常用的电离源为电喷雾离子源(ESI),本研究使用大气压力化学离子源(APCI)。方法建立阶段,本研究比较了使用APCI和ESI两种离子源的各自加巴喷丁离子强度,结果显示:用APCI离子源,加巴喷丁离子强度较大,本研究测定方法定量下限为20.00ng/mL,低于文献报道[5-15]。

本研究采用甲醇沉淀血浆中蛋白,沉淀离心后,定量吸取200μL上清液与800μL水相混匀,提高进样分析样品中水相的比例接近流动相中水的比例,防止二次化学平衡现象发生,可以使加巴喷丁色谱峰形减少拖尾。许萌等[16]在离心步骤后取上清液,经滤膜滤过后直接进样,本研究取上清液200μL,并加入到水相800μL中,混匀后进样,样品中血浆生物基质减少,可以降低基质效应和减少液质联用仪、色谱柱被污染的可能。

该液质联用方法测定血浆中加巴喷丁浓度,每个样品运行时间短,特异性高,甲醇直接沉淀蛋白,操作快捷,发挥了LC-MS/MS法的快速定量优势,可以满足大批量血浆样品检测的需要。

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