雷帕霉素对膀胱癌5637细胞增殖及细胞周期的影响

（辽宁省肿瘤医院泌尿外科，沈阳 110024）

雷帕霉素对膀胱癌5637细胞增殖及细胞周期的影响

单广夷，付成，陈昂，胡滨，毕缓

（辽宁省肿瘤医院泌尿外科，沈阳 110024）

目的探讨雷帕霉素对膀胱癌5637细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法5637细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。处理组加入50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素，对照组不加药物，每天更换RPMI 1640培养液。MTT法检测处理组的生长抑制率，流式细胞术检测不同浓度的雷帕霉素对5637细胞增殖周期的影响。结果与对照组相比，雷帕霉素对5637细胞有明显抑制作用，呈浓度依赖性和时间依赖性。雷帕霉素可以将5637细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞的增殖，且未见明显的凋亡情况。结论雷帕霉素使5637细胞阻滞在G0/G1期，抑制了膀胱癌5637细胞的增殖，说明雷帕霉素的作用靶点参与了5637的增殖过程，其有望成为膀胱癌治疗的新靶点。

雷帕霉素；5637细胞；增殖；细胞周期

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，是全身十大常见肿瘤之一，发病率排在第9位。膀胱癌主要治疗手段为手术治疗，术后辅助膀胱灌注药物或静脉化疗，从而降低肿瘤的复发率及死亡率。雷帕霉素又名西罗莫司，是一种新型的大环内脂类免疫抑制剂，可用于心脏支架［1］、器官移植［2］、阿尔兹海默症［3］、保护心肌［4］、免疫治疗［5］、抑制炎症、抗纤维化［6］、抑制血管内皮生长等多个方面。哺乳动

物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K/Akt/mTOR通路中一种重要的蛋白激酶，是该通路的关键环节，可通过它来实现对细胞生长代谢的调控。mTOR通路对细胞外生长因子、营养素、葡萄糖、氨基酸［7］等物质的代谢起到重要作用，目前已发现多种mTOR抑制剂，如雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、坦西莫司等。雷帕霉素具有对mTOR的独特抑制作用，因此对雷帕霉素的深入研究可以为治疗膀胱癌找到新方法。雷帕霉素可作用于乳腺癌［8］、肺癌［9］、骨肉瘤［10］、胰腺癌［11］等多种恶性肿瘤。在抑制肿瘤细胞的同时，雷帕霉素同样也是化疗药物的增敏剂。本研究主要探讨雷帕霉素对膀胱癌5637细胞系的增殖及细胞生长周期的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

雷帕霉素（美国LC公司）；人膀胱癌细胞系5637（中国科学院细胞库）；MTT、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；细胞周期检测试剂盒（凯基生物公司）；酶标仪（北京普朗医疗公司）；RPMI 1640培养基（美国HyClone公司）；胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代：膀胱癌5637细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中传代培养。雷帕霉素溶于无水乙醇，过滤除菌后-20℃保存，使用时RPMI 1640稀释。待接种的细胞进入对数生长期后，空白对照组不加入雷帕霉素，处理组加入50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素，每天更换培养液。

1.2.2 检测细胞生长抑制率：采用MTT比色法，5637细胞经胰酶消化后接种于96孔板，每孔加100 μL含105个细胞的培养液，贴壁培养24 h后，每孔再加入100 μL培养液，使雷帕霉素终浓度为50、100、200和400 nmol/L，每孔设4个复孔并设对照孔（加细胞不加药物）和凋零孔（加培养液不加细胞），培养24、48和72 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，再培养4 h，弃培养液。每孔加DMSO 150 μL，避光振荡混匀，结晶溶解后用酶标仪测波长490 nmol的吸光度（optical density，OD）值。按照公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡：取对数生长期的5637细胞，6孔板铺板过夜，梯度浓度加入雷帕霉素0、50和100 nmol/L，作用48 h后收集1×106个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。用预冷的PBS溶液清洗2次，加入70%冰乙醇5 mL混匀固定，4℃过夜，离心收集细胞，PBS再清洗细胞1次，在离心管中留1 mL PBS，仔细打散细胞团，加入RNaseA 5 μL（10 mg/mL），37℃温浴30 min，加入500 μL含50 μg/mL溴化乙锭的PBS，室温避光30 min，计数10 000个细胞，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件处理数据，数据用x±s表示，计量资料比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测雷帕霉素抑制5637细胞增殖

MTT结果显示，50 nmol/L的雷帕霉素作用24 h的生长抑制率为（21.53±0.69）%，400 nmol/L的雷帕霉素作用24 h的生长抑制率则达到（26.54±0.65）%，差异有统计学意义（P=0.000）。400 nmol/L的雷帕霉素作用72 h的生长抑制率明显升高，为（50.61± 0.90）%，是50 nmol/L雷帕霉素作用24 h的生长抑制率的2倍多。50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素作用5637细胞24、48、72 h后，随着药物浓度和时间的延长，对5637细胞有明显的抑制效果，呈时间和浓度依赖性。见表1。

表1 雷帕霉素作用5637细胞后的生长抑制率比较（%）Tab.1 The inhibition rate of rapamycin on 5637 cell（%）

2.2 流式细胞仪检测雷帕霉素对5637细胞周期的影响

雷帕霉素作用5637细胞48 h后，对照组、50 nmol/L组和100 nmol/L组G0/G1期细胞比例呈增加趋势，说明雷帕霉素将大量5637细胞阻滞在了G0/G1期，而S期与G2/M期细胞比例呈递减趋势，表明处于DNA合成期及合成后期的细胞减少。5637细胞的凋亡率未见明显变化（P＞0.05）。见表2，图1。

表2 雷帕霉素作用48 h后对5637细胞生长周期的影响（%）Tab.2 The effect of rapamycin on cell cycle of 5637 cells after 48 h（%）

图1 流式细胞仪检测雷帕霉素作用48 h后对5637细胞生长周期的影响Fig.1 The effect of rapamycin on cell cycle of 5637 cells after 48 h detected by flow cytometry

3 讨论

膀胱灌注和静脉化疗是治疗膀胱癌的重要手段，但是膀胱灌注和静脉化疗均有不同程度的药物不良反应，给患者的治疗信心带来影响。而mTOR抑制剂可以通过信号通路更准确的破坏肿瘤生长进程，毒副作用较低，特异性较强。雷帕霉素最早是以抗生素的形式被发现，上世纪90年代中期多项研究发现雷帕霉素具有抗肿瘤作用，如抑制增殖、抑制血管内皮生长［10］、调节凋亡［11］等。本研究结果表明，50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素作用5637细胞24、48和72 h后，随着雷帕霉素药物浓度的增加及时间的延长，对膀胱癌5637细胞有明显的生长抑制作用，呈时间和浓度依赖性。表明雷帕霉素作为mTOR的抑制剂，可以抑制5637细胞中的mTOR活性，从而说明mTOR参与了5637的增殖过程，是细胞增殖过程中的关键因子。因而，探讨mTOR抑制剂的作用，可以为膀胱癌治疗提供新的治疗方案，其有望成为膀胱癌治疗的新靶点。

细胞的增殖是产生新细胞，代替衰老、死亡和损伤细胞的过程。细胞的增殖即是细胞分裂的过程，分为DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）。在肿瘤增殖的过程中，如果阻断细胞生长的任一周期，则细胞增殖的过程将被阻滞，肿瘤的生长将被抑制。通过流式细胞仪检测表明，雷帕霉素作用5637细胞48 h后，对照组、50 nmol/L组和100 nmol/L组G0/G1期细胞比例呈递增趋势（P＜0.05），而S期与G2/M期则呈递减趋势（P＜0.05），5637细胞的凋亡率则未见明显变化（P＞0.05）。说明雷帕霉素将大量5637细胞阻滞在了G0/G1期，使处于DNA合成期及合成后期的细胞减少，从而抑制了膀胱癌5637细胞的增殖，这一过程与凋亡无关。

近年发现，mTOR具有两种复合物，即mTORC1和mTORC2，因此雷帕霉素具体作用还需进一步研究。雷帕霉素抑制肿瘤的机制仍未被完全掌握，具有进一步研究的价值。

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（编辑陈姜）

EffectofRapamycin on Proliferation and CellCycle of Human Bladder Carcinoma CellLine 5637

SHANGuang-yi，FUCheng，CHENAng，HUBin，BIHuan
（DepartmentofUrology，Liaoning Cancer Hospital&Institute，Shenyang 110024，China）

Objective To evaluate the effect of rapamycin on proliferation and cell cycle of human bladder cancer cell line 5637.MethodsTotally 5637 cellswere maintained in RPMI1640 containing 10%fetalbovine serum，100 U/mLpenicillin and 100μg/mLstreptomycin foradherentculture.Cells were grown at 37℃in a 5%CO2incubator.The 5637 cells were treated with various concentrations of rapamycin solution（50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L，and 400 nmol/L）.The control group was daily treated with single RPMI 1640 without medication.The growth repression rate for 5637 cells was evaluated by MTT.Flow cytometry was used to investigate the effect of rapamycin of different concentrations on cell cycle of 5637 cells.ResultsCompared to the control group，rapamycin can inhibit the proliferation of 5637 cells in a concentration and time dependent manner.Rapamycin inhibited 5637 cells at G0/G1thus inhibiting cell proliferation but not inducing apoptosis.ConclusionRapamycin inhibited growth of 5637 bladder carcinoma cells and arrested cell cycle at G0/G1，indicating that mammalian target of rapamycin may play an important role in proliferation of5637 cells and actas a new tumortherapeutic targetin patients with bladdercancer.

rapamycin；5637 cell line；proliferation；cell cycle

R737.14

A

0258-4646（2015）03-0230-04

辽宁省自然科学基金（20092028）

单广夷（1982-），男，主治医师，博士. E-mail：szlsgy@126.com

2014-12-10

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