高效液相色谱法检测猪肉中氟喹诺酮类药物残留的研究

氟喹诺酮类药物是新一代广泛应用的抗菌素，具有抗菌广谱的特性，高效低毒，抗菌作用力强，低廉价格。氟喹诺酮类药物广泛用于预防、治疗畜禽疾病，少量使用有一定的促进生长作用，但使用不当或过量使用可造成动物产品中药物残留;人体摄入后可导致细菌耐药性，并对中枢神经系统造成不良反应。欧盟和北美国家只批准恩诺沙星为动物专用的抗菌药，环丙沙星已禁止在水产养殖业中使用。我国农业部于2002年12月24日发布了第235号公告，对动物性食品中兽药最高残留限量予以规定。其中，规定达氟沙星、恩诺沙星在猪肉中的最高残留限量为100微克/公斤。

目前，常用的测定动物性食品中氟喹诺酮类及其活性代谢物残留量的方法主要有：酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱质谱法等。而高效液相色谱法具有快速、灵敏、准确等特点，是目前应用最多的方法。

在本研究中，笔者应用高效液相色谱法对来自农贸市场的100批次猪肉样品进行四种氟喹诺酮类药物残留的检测，旨在验证高效液相色谱法检测猪肉中氟喹诺酮类药物残留的可行性;调查市场中流通猪肉氟喹诺酮类药物残留的实际情况，为动物卫生监督部门预防和治理食品安全问题提供依据和参考。

一、材料与方法

1.仪器和设备 美国WATERS公司2695型高效液相色谱仪，配有2475荧光检测器。

2.试剂和材料 环丙沙星（中国食品药品检定研究院），恩诺沙星、沙拉沙星、达氟沙星（中国兽医药品监察所），色谱纯乙腈（Fisher公司），色谱纯甲醇（Fisher公司），水为二次蒸馏水，磷酸、氢氧化钠、三乙胺、磷酸二氢钾、50毫升聚乙烯离心管、0.5微米微孔滤膜。100批次猪肉样品，分别于2014年上半年不同时期在多个市场随机抽取。样品编号为：PM/CL2014001～PM/CL2014100。

3.方法 ①标准品和溶液的配置。应用感量为0.00001克的电子天平精确称量恩诺沙星（ENR）、沙拉沙星（SAR）、环丙沙星（CIP）各0.025克，达氟沙星（DAN）0.01克。用0.03摩尔/升氢氧化钠溶液溶解稀释定容至50毫升容量瓶中，使其浓度为：恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星约0.5毫克/毫升，达氟沙星约0.2毫克/毫升的标准储备液，保存在2～8℃的冰箱中，有效期为3个月。应用移液器吸取25微升的标准储备液，取乙腈稀释定溶至10毫升的容量瓶中，使其浓度为恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星约1.25微克/毫升，达氟沙星约0.5微克/毫升的标准工作液，现用现配。0.03摩尔/升的氢氧化钠溶液：称取1.2克氢氧化钠加水溶解稀释至1000毫升。磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钾13.6克，加水溶解稀释至1000毫升，用5摩尔/升的氢氧化钠溶液（取20克氢氧化钠用水溶解定容至100毫升）调节pH至7.0±0.2。0.05摩尔/升的磷酸/三乙胺溶液：取浓磷酸3.4毫升，用水稀释至1000毫升，用三乙胺调pH至2.4。②样品处理及提取。应用绞肉机将约500克猪肉样品全部充分绞碎，量取2±0.05克肉样至50毫升聚乙烯离心管中，同法另取空白样品两份，其中一份空白样品添加氟喹诺酮类标准品。每个离心管中加磷酸盐缓冲液10毫升，应用蜗旋混合器将样品充分混匀，超声波清洗器超声5分钟，振荡器中速振荡10分钟，10000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一50毫升离心管中备用。重复以上提取步骤，合并2次上清液20毫升充分混匀待净化。LC-C18（500毫克/3毫升）固相萃取柱首先用甲醇、磷酸盐缓冲液各5毫升活化，取5毫升上清液过柱，用水3毫升淋洗，挤干。用流动相3毫升洗脱，挤干，收集洗脱液。经0.5微米微孔滤膜过滤，装瓶待上机。③色谱条件。色谱柱：Athena C18-WP.100A.4.6毫米×250毫米.5微米;流动相：0.05摩尔/毫升的磷酸/三乙胺溶液——乙腈（82∶18，体积比）;流速∶1毫升/分钟;柱温：35±5℃;进样体积：20微升;检测波长：激发波长280纳米，发射波长450纳米。

二、结果与分析

1.计算公式 X=CsVA/AsM（纳克/克）式中：X-样品中恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星残留量（纳克/克），Cs-标准工作液中恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星的浓度（纳克/毫升），V-样品稀释倍数，A-样品溶液中恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星的峰面积，As-两个平行标准工作液中恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星峰面积的平均值，M-样品的质量（克）。

2.标准品色谱图 由图1可以看出各组份分离完全，峰型良好，无分叉、拖尾、前沿现象，说明色谱条件合适，色谱柱效能高，流动相配比合理，标准品有效未降解。

3.方法回收率 每次实验附带1批次空白样品和1批次空白添加样品（添加量已知）。其回收率（RC）公式为：RC=空白添加样品测定值/空白添加样品添加值×100%。本研究共进行7次实验，空白添加氟喹诺酮类标准品浓度为：恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星为12.5纳克/克，达氟沙星为5纳克/克（见图2），其回收率均在73.7%～96.6%之间，说明其样品处理、净化效率高，损失待测组分少。

4.样品结果分析 从表1可以看出，100批次猪肉样品共有11批次检出有氟喹诺酮类药物残留，检出率11%。其中PM/CL2014007被检测出含有达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星三种药物，PM/CL2014013、023被检测出含有达氟沙星、恩诺沙星两种药物，PM/CL2014069被检测出含有环丙沙星、恩诺沙星两种药物。从表2可以看出，四种氟喹诺酮类药物检出率最高的是恩诺沙星，达到10%，其他三种药物检出率在1%～3%之间。在检出的11批次样品中含量均未超过我国农业部第235号公告中对该类药物最高残留限量为100微克/公斤的限量值。

三、结论与讨论

通过对100批次猪肉样品中四种氟喹诺酮类药物的检测可以看出，应用高效液相色谱法检测氟喹诺酮类药物灵敏、准确，便于推广;11%的高检出率表明此类药物在育肥猪养殖中应用广泛。恩诺沙星的检出率尤为突出，有关部门应重点监督。四批次样品检测有二种以上的氟喹诺酮类药物，说明存在滥用兽药以及兽药产品不规范等问题。11批次被检出样品均未超标，说明待售动物都执行了休药期的规定;但低含量的抗生素并不代表对使用者没有危害。研究者通过实验证明，亚剂量的抗生素可使细菌发生基因突变，从而产生多重或单重耐药性。猪肉中若存在亚剂量的抗生素，可通过选择压力方式，导致细菌发生突变，从而使其获得抵御抗生素的能力。如果人使用含有耐药菌株的猪肉后，可能会发生耐药菌株在体内蓄积，如果耐药菌株把耐药基因通过基因交换传播给体内的致病细菌，将会使人体诱发严重疾病。所以，有关部门应指导合理使用抗生素，严格执行动物使用抗生素的休药期，不定期监督抽检氟喹诺酮等抗生素的残留限量。

作者简介 曹忠君（1979-），男，硕士，畜牧师，主要从事畜产品兽药残留检测工作。