猪APOBEC3F 基因外显子8 单核苷酸的多态性及其与猪繁殖和呼吸综合征病毒易感性的关联性

朱前明，孟春花， 茆达干， 王慧利， 李静心， 王 婧1，， 王亚磊1，，

曹少先1，3

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京210014;2.南京农业大学动物科学与技术学院，江苏 南京210095;3.江苏省农业科学院动物品种改良和繁育重点实验室，江苏 南京210014)

载脂蛋白质B mRNA 编辑酶催化多肽3F(APOBEC3F)是APOBEC 家族的一员，具有广泛的抗病毒活性，可有效地抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、猪内源性逆转录病毒(PERV)等病毒的复制，在宿主抗病毒天然免疫应答中发挥着重要作用［1-4］。APOBEC3F 含有2 个相同的胞嘧啶脱氨基模体即His/Cys-X-Glu-X23-28-Pro-Cys-X2-Cys，分别位于基因编码蛋白质的第85 ～119 位和265 ～299 位。C 端脱氨基模体是其发挥脱氨基作用的主要活性区域，N 端模体脱氨基作用较弱，主要与APOBEC 分子衣壳化、RNA 结合及二聚体的形成有关，但两者都是发挥脱氨基功能必不可少的部分［5-8］。其主要作用机制是细胞内APOBEC3F 分子通过gag 蛋白质［6］、病毒RNA［7］、细胞RNA［8］的媒介进入成熟病毒粒子的核心，并在随后感染的靶细胞中使新合成的负链cDNA 发生C/T 突变，从而导致新合成的DNA 降解或产生大量致死性的G/A 突变来抑制病毒的复制与感染［9-12］。

有研究结果表明APOBEC3F基因的抗逆转录病毒特性具有普遍性［13-14］。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种高度传染性疾病。2006 年中国南方暴发的猪高热病对中国养猪业造成巨大的经济损失，其病原就是变异的高致病性PRRSV［15-16］。通过分离猪肺泡巨噬细胞体外攻毒PRRSV 的方法来分析猪PRRSV 易感性差异是一种有效的试验模型［17］。猪APOBEC3F基因虽然已经被克隆［18-19］，但关于APOBEC3F基因的多态性及其与PRRSV 易感性的关联研究尚未见报道。本研究对多个猪种APOBEC3F基因外显子3、4、8 和内含子3 进行测序，寻找多态性位点，并分析其与PRRSV 易感性的关联性，以期检测到与PRRSV 易感性相关的分子标记，为抗PRRSV 猪育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验猪包括9 个品种，共193 头，其中杜洛克猪36 头(购自杭州大关猪场)、长白猪42 头(购自杭州大关猪场)、大白猪38 头(购自杭州大关猪场)、苏钟猪34 头(购自江苏省农业科学院动物科学基地猪场)、姜曲海猪14 头(购自江苏姜曲海猪场)、定远猪12 头(购自安徽定远县猪场)、二花脸猪5 头(购自江苏省常熟市畜禽良种有限责任公司)、梅山猪5 头(购自江苏太仓市种猪场)、三元杂交猪7 头(购自镇江丹徒区云立牧业有限公司)。每个个体取耳组织于冻存管中，置于液氮中保存。PRRSV NJGC 株由江苏省农科院兽医研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 组织样DNA 提取 耳组织样的DNA 提取采用酚/氯仿抽提法，TE buffer 溶解后，-20 ℃保存。

1.2.2APOBEC3F基因外显子3、4 和8 扩增 参照猪APOBEC3F基因外显子3、4、8 和内含子3 序列分别设计A3F-A、A3F-B 2 对引物，由上海捷瑞公司合成，引物信息见表1。PCR 反应总体系20.0 μl，其中含模板DNA 为60 ng，2.5 U/μl PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 为0.2 μl，2 mmol/L dNTPs 为1.6 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，5× Prime-STAR®Buffer(包含Mg2+)为4.0 μl，最终加灭菌蒸馏水至20.0 μl。

PCR 反应程序:98 ℃变性10 s;各引物最适温度复性5 s，72 ℃延伸1 min 20 s，35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，检测扩增结果。

1.2.3 多态位点的测序和筛选 每6 头猪DNA 等量混合构建DNA 池，构建3 个不同的DNA 池，进行PCR 扩增，电泳纯化后的PCR 产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.2.4 PCR-RFLP 分析 根据测序结果选择外显子8 的5 bp 处的多态位点，建立PCR-RFLP 检测方法，引物Nrul-SNP 序列见表1。PCR 反应总体系20.0 μl，含模板DNA 60 ng，Taq聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.4 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.4 μl，10 ×缓冲液2.0 μl，加灭菌蒸馏水至20.0 μl。PCR 扩增条件为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，引物最适温度复性30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环;最后72 ℃延伸7 min。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，检测扩增结果。

用Nrul酶对引物Nrul-SNP 扩增的PCR 产物进行酶切分型。酶切反应体系为16.0 μl:含PCR 产物5.0 μl，Nrul(10 U/μl)0.5 μl，10 × T buffer 1.0 μl，灭菌蒸馏水9.5 μl，37 ℃反应4 h。2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB 染色，培清JS-780 全自动凝胶成像分析仪进行拍照分析。

1.2.5 PRRSV 易感性测定 参照Ait-Ali 等［17］的方法进行。简要步骤如下:分离猪肺泡巨噬细胞，接种PRRSV 病毒，分别在接毒后6 h、12 h、18 h、24 h和36 h 收集细胞，提取RNA 反转录成cDNA。针对β-actin基因、PRRSV 毒株N基因序列分别设计特异性引物β-actin和PRRSV-N(表1，由上海捷瑞公司合成)。以cDNA 为模板PCR 扩增基因片段，克隆至T 载体，以此为模板，SYBR Green I 染料法进行定量PCR(ABI7300)，绘制标准曲线。以PRRSVN基因的拷贝数与β-actin基因拷贝数的比来计算病毒载量，作为易感性的参数。每组3 个重复。反应体系为20.0 μl，其中SYBR PremixEx Taq10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl，ROX 0.4 μl，模板2.0 μl，灭菌去离子水6.4 μl。反应条件为:95℃预变性30 s;95 ℃5 s，56 ℃31 s，40 个循环，每个循环结束时收集荧光信号。

表1 引物信息Table 1 The information of primers used in this study

1.2.6 数据分析 不同猪种群体不同基因型的PRRSV 易感性数据分别用SPSS17.0 软件的One-Way ANOVA 进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 APOBEC3F 基因片段的扩增及SNP 筛选

对猪APOBEC3F基因内含子3 进行PCR 扩增，在1 000 ～2 000 bp 间出现1 条特异性条带(图1)与预期结果一致。对猪APOBEC3F基因外显子8 进行PCR扩增，在1 000 ～2 000 bp 间出现1 条特异性条带(图2)与预期结果一致。测序结果显示，在内含子3 的16 bp 处出现1 个A/G 突变(图3)。在外显子8 的5 bp处出现1 个G/A 突变(图4)。经分析外显子8 的5 bp处出现G/A 突变处于Nrul酶切位点内，而内含子3 的16 bp 处A/G 突变引物不易设计，即使用人为创造酶切位点的方法也不能找到合适的限制性内切酶。

2.2 PCR-RFLP 分析

针对外显子8 的5 bp 处G/A 的单碱基突变设计特异性引物，命名为Nrul-SNP。对猪DNA 进行PCR 扩增，在500 bp 与750 bp 之间得到1 条特异性条带(图5)，与预期结果一致。用限制性内切酶Nrul对引物Nrul-SNP 扩增的PCR 产物进行酶切分型，以PCR 产物作为对照电泳，AA 型为1 个572 bp片段;GG 型为379 bp 和193 bp 2 个片段;GA 型为572 bp、379 bp 和193 bp 3 个片段(图6)。

图1 猪APOBEC3F 基因内含子3 PCR 扩增产物电泳图Fig.1 PCR amplification of APOBEC3F intron three

图2 猪APOBEC3F 基因外显子8 PCR 扩增产物电泳图Fig.2 PCR amplification of APOBEC3F exon eight

图3 APOBEC3F 基因内含子3 单碱基突变Fig.3 Single-base mutation in intron three of APOBEC3F gene

图4 APOBEC3F 基因外显子8 单碱基突变Fig.4 Single-base mutation in exon eight of APOBEC3F gene

图5 Nrul-SNP 引物PCR 产物电泳图Fig.5 PCR amplification with primer Nrul-SNP

2.3 APOBEC3F 基因群体的遗传特征

2.3.1 基因频率及基因型频率在猪群体中的分布

在各猪种群体中外显子8 的5 bp 处可以检测到3种基因型，以GG 型居多，GA 型次之，AA 最少;定远猪和梅山猪群体中检测到3 种基因型;二花脸猪群体中检测到GG 和GA 2 种基因型;其他猪群体只检测到GG 1 种基因型。在所有被检测猪种群体中，G等位基因的频率均高于A等位基因，因此G为优势等位基因(表2)。

图6 PCR 产物的Nrul 酶切分型Fig.6 Identification of PCR products with Nrul

表2 APOBEC3F 基因外显子8 的5 bp 处基因型频率、等位基因频率及群体遗传特征Table 2 Genotypic frequency and allelic frequency at 5 bp of exon eight of APOBEC3F gene and population inheritance character

表3 不同基因型猪PAM 接毒后PRRSV 拷贝数Table 3 The relative amount of PRRSV in porcine alveolar macrophage(PAM)of different genotypes of pig

2.3.2 遗传特性 外显子8 的5 bp 处在定远猪、梅山猪和二花脸猪群体中为中度多态(0.25 ＜PIC＜0.50)，而在其他群体中未表现出多态性，表明该多态位点在定远猪、梅山猪和二花脸猪群体中存在较强的选择潜力(表2)。采用χ2适合性检验检测发现该基因座位在定远猪、二花脸猪和梅山猪群体中均未偏离Hardy-Weinberg 平衡(P＞0.05)。

2.4 不同基因型猪种群PRRSV 易感性

比较APOBEC3F基因外显子8 的5 bp 处不同基因型猪肺泡巨噬细胞(PAM)接毒后PRRSV 拷贝数(表3)发现，AA 基因型猪PAM 细胞接毒后12 h PRRSV 拷贝数显著高于GG 型(P＜0.05)，极显著高于GA 基因型(P＜0.01)。

3 讨论

大量研究结果表明APOBEC3F基因具有抑制HIV［1］、PERV［3］、MLV［20］等反转录病毒复制的作用。Jonsson 等［14］研究发现偶蹄动物牛、羊和猪APOBEC3F 主要定位在细胞质，并能抑制HIV-1 和MLV 的复制。王雄虎等［21］研究发现APOBEC3F基因第4 外显子536 位点T/C 突变可能与感染HBV易感性有关。而猪APOBEC3F基因多态性及其与PRRSV 抗性相关性的研究尚未见报道。本研究以APOBEC3F基因为候选基因，结合DNA 池PCR 扩增产物测序方法，发现了猪APOBEC3F基因2 个单碱基突变(内含子3 的16 bp 处出现A/G 突变和外显子8 的5 bp 处出现G/A 突变)。外显子8 的5 bp处可以检测到3 种基因型，以GG 型居多，GA 型次之，AA 最少，且该位点多态性在不同猪种间存在明显的差异。其他种猪群体中没有多态性，可能与长期的人工选育有关。内含子3 的16 bp 处的A/G 突变找不到合适的限制性内切酶来设计PCR-RFLP 或者CRS-PCR-RFLP 方法，因此该位点还需探索其他的检测方法以进一步研究。

比较外显子8 的5 bp 处不同基因型猪PAM 细胞接毒后PRRSV 拷贝数发现，AA 型猪PAM 细胞接毒后12h PRRSV 拷贝数显著高于GG 基因型(P＜0.05)，极显著高于GA 基因型。表明AA 型猪PRRSV 易感性高于GG 型和GA 型，提示G等位基因更有利于抵抗PRRSV 的感染。

通过数据库查询对比可以得出，本研究检测到外显子8 的5 bp 处G/A 突变是有义突变，导致APOBEC3F基因所编码蛋白质的第391 位的丙氨酸(Ala)变成苏氨酸(Thr)。有研究结果［12］显示APOBEC3F 含有两个胞嘧啶脱氨基模体，并且C 端脱氨基模体是其发挥脱氨基作用的主要活性区域，N 端模体脱氨基作用较弱，主要与APOBEC 分子衣壳化、RNA 结合及二聚体的形成有关。虽然该处的氨基酸改变不在脱氨基结构域上，但有研究显示失去胞苷脱氨基作用的APOBEC3F 分子依然具有抗病毒作用［22］，APOBEC3F 分子的脱氨基模体是其发挥抗病毒作用的分子基础，但并不是其抗病毒作用的唯一途径。A5T 突变是否通过其他途径改变APOBEC3F 的抗病毒作用还有待进一步研究和探讨。

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