破碎小球藻细胞提取生物油脂新方法

李 亮，李洋洋，黄远星，宋翠红，程豪奇

(1.上海理工大学环境与建筑学院，上海200093;2.中国石油化工股份有限公司洛阳分公司，河南洛阳471012)

随着世界能源的加剧消耗以及实现低碳经济的迫切需要，生物质能源引起了全世界人们的广泛关注［1-3］.生物质能源通过植物的光合作用将太阳能转化为化学能，具有可再生、转化效率高、对环境污染小等优点，具有广阔的应用前景［4］.由于目前以油料作物为原料的生物柴油产率低、占用大量耕地等条件的限制［5］，以及藻类具有可以大规模人工培养、环境适应能力强、生长周期短、单位面积生物量大的特点［6-9］，使得藻类成为制备生物油燃料的良好材料.由于小球藻倍增时间短，与其他高油脂密度微藻相比，普通小球藻在供给生物油脂方面有一定的竞争力［10］.

为了更好地利用微藻产油，首先要对微藻藻体破壁，由于微藻细胞较小、且具细胞壁结构，油脂都包裹在微藻细胞内［11］，因此采用细胞破壁后进行提取是目前利用微藻生产生物能源的一个难点.目前国内外微藻油脂破壁提取技术主要包括:匀浆器破碎［12］，玻珠研磨机(砂磨机)研磨［13］，超声波破碎［14-15］，微波破碎［16］，高压釜加温加压破碎［17-18］，反复冻融法破碎［19］，有机溶剂裂解［20］，渗透压冲击［21］，酶裂解［22］，脉冲电磁场法［23］等.细胞破碎是从藻类中提取微生物油脂必不可少的一个环节，在实际的生产和应用过程中，人们会根据不同的藻类种属，藻类生长状态，不同的加工要求和不同的目标提取物而灵活选用合适的细胞破碎技术.

在自然水体治理过程中，经常利用臭氧预氧化法来提高混凝除藻效果，有效地提高了原水中藻类去除率，减轻后续过滤工艺的堵塞情况［24-25］.目前利用臭氧氧化能力来破碎藻类细胞提取油脂的研究鲜有报道.本研究在传统臭氧预氧化水体中藻类的研究基础之上，以加压-减压循环过程辅助臭氧氧化法，旨在探索一种破碎小球藻细胞壁的新方法.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验中所采用的小球藻藻种由武汉中科院水生生物研究所购得.试验中所采用正己烷和乙酸乙酯为 HPLC 纯，其余试剂如 NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、柠檬酸、柠檬酸铁铵、EDTANa2、Na2CO3等为化学纯，均由国药试剂有限公司购得.FAME标准样品(GLC-10)由美国Sigma-Aldrich公司购得.

1.2 试验方法

1.2.1 小球藻培养

小球藻用逐级放大法进行培养，第1步将小球藻藻种与BG11培养基按照体积比1∶5进行稀释培养2周.然后将所得藻液与BG11培养基按照1∶10进行再次稀释后培养2周.最后将所得藻液与BG11培养基按照1∶100进行稀释后培养2月.所得藻液即可应用于破碎试验中.整个培养过程在塞福PGX-350B智能培养箱中进行，温度为25℃，光照强度为5 000 lx，光暗时间各12 h.

1.2.2 压力辅助臭氧法

图1为本试验所采用的装置图.均匀量取250mL培养好的藻液，50 mL用以测定初始总固体悬浮物(total suspended soilds，TSS)质量浓度，另外200 mL置于高压反应釜中，调节机械搅拌器速度为120 r·min-1，转动5 min将溶液混匀.打开臭氧发生器，流量控制在2 L·min-1，臭氧与空气混合气体由空压机泵入高压反应釜中，观察压力表，达到一定压力后保持5 s后由释压阀突然释放，这一过程称为1个循环.经过不同压力和循环数处理后打开反应釜，所得小球藻藻液进行测定.

图1 试验装置图

1.3 检测方法

1.3.1 常规项目

TSS、化学需氧量 (chemical oxygen demand，COD)、氨氮、亚硝态氮、硝态氮、总氮、溶解性磷和总磷按照国家标准分析方法测定.

1.3.2 油脂产率

在破碎后小球藻藻液中加入正己烷和乙酸乙酯体积比1∶1的混合有机溶剂50 mL，分3次萃取，上层有机相14 000 r·min-1离心30 min，取上层有机相于旋转蒸发器上蒸法至有机溶剂全部挥发，称重计算出油率.油脂产率以提取物占小球藻干重的百分比计算.

1.3.3 气相色谱-质谱分析(GC-MS)条件

将油脂溶解在1 mL正己烷中，随后加入200 μL浓度为2 mol·L-1的氢氧化钾甲醇溶液，剧烈搅拌2 min后分层，收集上层有机相，并利用GC-MS(Agilent GC 7890-MS 5975)进行成分分析.所用色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱(FS 30 m×ID 0.25 mm×DF 0.25 μm)，载气为高纯氦气(99.999%)，不分流进样，载气流速为1.0 mL·min-1，进样口温度为270℃;程序升温方式，初温50℃，保持1 min，第1阶段升温速率15℃·min-1，升至180℃;第2阶段升温速率7℃·min-1，升至230℃;第3阶段以30℃·min-1的速率升至300℃，保持10 min.MS为扫普模式，质量范围为20～500 u.将所得谱峰与NIST标准数据库及标准样品对比进行定性分析.

2 结果与讨论

2.1 压力辅助臭氧法破碎效果分析

在最大压力为0.8 MPa、加压-减压循环数为80次的条件下对培养所得小球藻藻液进行破碎试验.破碎后，溶液中氨氮从小于0.4 mg·L-1上升至0.9 mg·L-1，亚硝酸盐从 6.90 mg·L-1下降至0.06 mg·L-1，硝酸盐从 191 mg· L-1上升至201 mg·L-1，总氮质量浓度从216 mg·L-1上升至284 mg·L-1.对数据研究后发现，无机氮质量浓度在破碎后仅仅上升了4.1 mg·L-1，但是总氮质量浓度上升了68 mg·L-1，这表明溶液中有大量有机氮生成，这可能是由于小球藻细胞破碎后细胞内物质外流引起的.除此之外，溶解性磷和总磷质量浓度分别由初始的0.07和 1.6 mg·L-1上升至 0.31 和14.3 mg·L-1，这也间接证明了小球藻细胞破碎后有大量细胞内物质溶解进入水相中.

2.2 不同压力对油脂产率的影响

在细胞破碎过程中，压强的增大促使细胞内外压力差增大，高压促使细胞产生裂缝，此时突然加压使小球藻细胞内含物通过狭缝瞬间释放，最终使细胞破碎.另一方面，臭氧的氧化性直接破坏细胞的结构，也可以促使细胞破裂［26］，这都有利于破碎小球藻细胞.不同压力对小球藻细胞破碎及油脂产率的影响结果见图2，循环次数为80.

图2 不同压力对小球藻细胞破碎及油脂产率的影响

溶解性COD可以反映水中有机物含量的多少，从图2中可以看出压力的增加促使溶液中溶解性COD含量的增加，这在一定程度上反应了藻类细胞的破碎程度.当压力从0.6 MPa增加到0.8 MPa时，COD数值显著增加，这说明小球藻细胞破碎程度随着压力的增加而增加.此外，随着压力的逐渐增大，小球藻的油脂产率先升高后下降.压力在0.6 MPa时油脂产率达到最大的26.7%，这与曹春晖等关于小球藻的油脂含量研究中小球藻的油脂含量一般为8%～27%相一致［27］.但随着压力的进一步增加，出油率有所下降.这可能是因为在较为剧烈的条件，小球藻细胞破碎后进入水相中有机物被进一步氧化生成某些中间产物［28］.

2.3 循环数对油脂产率的影响

0.6 MPa压力下不同循环数对小球藻细胞破碎及油脂产率的影响见图3.从图3中看出，当加压-减压循环数从20次增加到40次并最终增加到80次时，小球藻产油率从11.8%增加至17.6%并最终增加到26.7%.显而易见循环数的增加，小球藻的出油率随之增加.在这个过程中，溶解性COD的变化比较小，位于213～275 mg·L-1范围内.这可能与小球藻细胞破碎后流出物质的性质有关，某些有机物的溶解度比较小，难以进入水相中.循环次数的增加意味着小球藻加压-减压过程次数的增多，加压-减压的过程中会进一步增加细胞之间的碰撞程度，并且增加臭氧与小球藻的接触几率，这样做会使细胞破碎的更完全，细胞质更容易流出，更加有利于油脂的提取.

图3 不同循环数对小球藻细胞破碎及油脂产率的影响

2.4 油脂成分分析

生物柴油是以生物油脂(包括植物脂肪，动物脂肪等)与醇类物质(通常为甲醇，乙醇)通过酯交换反应得到的长链脂肪酸甲酯.醇类物质通常选甲醇，这是由于甲醇的价格较低，同时其碳链短、极性强，能够很快与脂肪酸甘油酯发生反应，且碱性催化剂易溶于其中.图4为制备生物柴油制备的反应方程式［29］，甲醇在催化剂下，与生物油脂中的甘油三酯发生酯交换反应，生成甘油和脂肪酸甲酯，甘油被分离后，得到的脂肪酸甲酯就是生物柴油.在酯交换反应中，可以用酸、碱或酶做催化剂进行催化［30］.

利用压力辅助臭氧法在0.8 MPa、80次循环数的条件下破碎小球藻细胞，经过萃取、浓缩、酯化等步骤后由GC-MS测定所得脂肪酸甲酯成分，其结果如表1所示.结果表明，色谱出峰主要集中在10～20 min范围内，其主要成分有:十四烷酸甲酯、13-甲基-十四烷酸甲酯、9-甲基-十四烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、14-甲基-十六烷酸甲酯及十八烷酸甲酯等.十六酸甲酯和十八酸甲酯为其主要成分，其相对比例分别高达40.4%及48.6%.根据试验结果可以推论小球藻破碎后其成分中长链脂肪酸有十四烷酸、13-甲基-十四烷酸、9-甲基-十四烷酸、十六烷酸、14-甲基-十六烷酸及十八烷酸等，其中十六烷酸和十八烷酸为其主要成分，与文献中利用其他方法提取的小球藻成分类似［31-32］.值得一提的是，本方法破碎后的小球藻中并未能检测到大量的不饱和脂肪酸，这可能与臭氧的强氧化性有关，不饱和脂肪酸在处理过程中被氧化生成了小分子有机物.

图4 制造生物柴油的酯交换反应

表1 小球藻提取物主要成分分析结果

3 结论

压力辅助臭氧法可以成功破碎小球藻细胞，破碎后体系中氨氮、硝酸盐、有机氮含量明显上升，亚硝酸盐下降，总氮含量上升.溶解性磷和总磷的含量也有明显增加.压力和循环数对小球藻破碎有着明显的影响.水相中溶解性COD含量随着压力增大、循环数增加而增加.经试验得到的臭氧加压法提取小球藻油最佳工艺条件为压力0.6 MPa，80次循环，在此条件下小球藻油有最大的萃取率26.7%.通过对小球藻藻油的GC-MS检测，确定了小球藻中多种脂肪酸，包含十四烷酸、13-甲基-十四烷酸、9-甲基-十四烷酸、十六烷酸、14-甲基-十六烷酸及十八烷酸等，其主要成分为C16∶0与C18∶0，相对比例高达40.4%及48.6%.本研究结果为提取微藻油脂提供了一种全新的可行方法.与传统的微藻藻油提取工艺相比，臭氧加压法萃取工艺简单，步骤少，相同条件下处理量大，同时在常温下进行试验可以减少高温条件下造成的油脂损失.

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