HPLC法测定中风通络丸中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量

潘 勇，刘丰贤，邹 辉

(1.湖南省肿瘤医院，湖南 长沙 410000;2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410000)

脑梗死又称为缺血性脑卒中，属于中医学的中风范畴，是脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织缺血性坏死或脑软化，而出现的相应的神经系统症状体征。今年来脑梗死的发病率呈现逐年上升的趋势，严重地威胁着人们的健康。按照中医理论，中风多发于“实”，归于“虚”，根据这一发病机制，目前临床上应用较广的是中风通络丸［1-2］。

中风通络丸由黄芪、葛根、丹参等16 味中药组成，是湘西土家族苗族自治州民族中医院名老中医经验方，经过大量的临床验证，治疗中风应用安全且具有较好的疗效。中风通络丸功能益气活血，化瘀通络，平肝息风，用于脑梗死恢复期气虚血瘀，风阳上扰证，症见半身不遂、口舌歪斜、语言不清、偏身麻木、头晕目眩等。本文用HPLC 法对其君药之一丹参的有效成分进行含量测定研究，旨在建立简便、有效、可靠的质量控制方法［3-4］。

1 实验材料

1.1 实验仪器

Shimadzu 高效液相色谱(UV 检测器，LC solution 色谱工作站);色谱柱是依利特Hypersil-ODS(4.6 mm ×250 mm，5μm)。电子天平(AND GH-202，十万分之一，日本)，超声波清洗器(KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 实验试剂

丹参酮ⅡA和丹酚酸B 对照品由湖南省药品检验研究院提供，供含量测定用;中风通络丸(批号:20121101、20121102、20121103)，由长沙同瑞医药科技开发有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯;其他试剂为分析纯;水为乐百氏纯净水经0.45μm 过滤后得。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取丹参酮ⅡA1.0 mg 和丹酚酸B 对照品3.0 mg，置50 mL 容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 供试品溶液和阴性对照溶液的制备［7］

取中风通络丸20 g，研碎，过80 目筛，精密称取10 g，置100 mL 容量瓶中，加甲醇50 mL，超声处理30 min，冷却后加甲醇至刻度，摇匀，静置备用。同法制备不含丹参的阴性样品溶液。

2.3 色谱条件［5-6］

色谱柱为依利特Hypersil-ODS (4.6 mm ×250 mm，5μm);流动相为乙腈－0.5%甲酸溶液;梯度洗脱:0 ～15 min，乙腈10% ～20%;15 ～25 min，乙腈20% ～50%;25 ～35 min，乙腈50% ～60%;35 ～40 min，乙腈60% ～95%，;流速为1.0 mL·min－1;检测波长丹参酮ⅡA为270 nm，丹酚酸B 为286 nm;柱温为30℃。

2.4 方法可行性考察

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，按上述色谱条件进样，丹参酮ⅡA和丹酚酸B 的色谱理论塔板数均大于10000，与相邻杂质峰的分离度＞1.5，对照品丹参酮ⅡA和丹酚酸B 以及供试品溶液、阴性对照溶液的色谱图见图1。

图1 样品色谱图(A 丹参酮ⅡA 对照品溶液;B 丹酚酸B 对照品溶液;C 供试品溶液;D 空白样品溶液)

2.5 线性关系

2.5.1 丹参酮ⅡA的线性关系考察

分别精密吸取“2.1”项下的对照品溶液10、14、18、22、26 μL，按上述色谱条件分别进样测定峰面积，以进样量X(μg)对色谱峰面积Y 进行线性回归求得丹参酮ⅡA的线性方程为:Y=4×106X+175439 (r =0.9998)，线性范围为0.1861 ～0.4839 μg。

2.5.2 丹酚酸B 的线性关系考察

分别精密吸取“2.1”项下的对照品溶液10、20、25、30、35μL，按上述色谱条件分别进样测定峰面积，以进样量X(μg)对色谱峰面积Y 进行线性回归求得丹酚酸B 的线性方程为:Y =2 ×106X +36551(r=0.9998)，线性范围为0.6258 ～2.1902μg。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液20，在“2.3”色谱条件下，连续进样6 次，分别测定丹参酮ⅡA和丹酚酸B 的峰面积，计算RSD 分别为0.18%、0.16%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液依次在0，2，4，8，12，24 h进样，测定峰面积，计算RSD 分别为0. 54%、0.20%，表明丹参酮ⅡA和丹酚酸B 溶液在室温避光条件下24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率考察

精密称取已知含量的中风通络丸粉末6 份，每份0.25 g，分别加入已知浓度的对照品溶液2、2、4、4、8、8 mL，按供试品制备方法，定容至50 mL，依法测定，结果见表1。

表1 丹参酮ⅡA 和丹酚酸B 的方法回收率

2.9 样品测定

按上述方法测定3 个批次的中风通络丸中丹参酮ⅡA和丹酚酸B 的含量，结果见表2。

表2 中风通络丸中丹参酮ⅡA 和丹酚酸B 的含量

3 讨论

采用不同溶剂(甲醇和乙醇)、不同提取方法和不同提取时间制备供试品溶液，结果发现，以甲醇超声提取30min 时，丹参酮ⅡA和丹酚酸B 的含量的含量最高，且制备的供试品色谱中杂质较少。探讨了不同流动相的分离效果，结果表明流动相为乙腈－0.5%甲酸溶液，进行梯度洗脱时，目标峰与杂质峰能很好地分离，且峰形对称，实验数据具有很好的准确度和精密度，且重现性较好，符合液相分析要求。

本文所述方法测定中风通络丸中丹参酮ⅡA和丹酚酸B 的含量，结果可靠，可作为该制剂的质量控制，建议本制剂丹参酮ⅡA的含量不低于0. 15 mg/g，丹酚酸B 的含量不低于0.9 mg/g。

［1］崔艳东.自拟中风通络汤治疗脑梗死的临床疗效观察［J］. 现代中医药，2012，32(4):5-7.

［2］胡永学，柳华伟，吴君红.中风通络汤预防溶栓后再梗死临床研究［J］.河北中医，2002，24(6):421-422.

［3］李向阳，屠玩倩，李振国. HPLC 测定强力宁片中紫丁香苷和甜菜碱的含量［J］.中成药，2007，29(5):700-703.

［4］蓝鸣生，陈路.五淋散中栀子苷和芍药苷的HPLC 含量测定［J］.中国新药杂志，2010，19(14):1281-1288.

［5］刘丰贤，刘江，周鹏. HPLC 法测定丹参调肝颗粒中丹参酮ⅡA的含量［J］.湖南师范大学学报(医学版)，2010，7(4):19-20.

［6］林佳，徐丽珍，李琰，等.不同产地丹参中丹参酮ⅡA的含量比较［J］.中国中药杂志，2002，27(2):153-154.

［7］张友芹.高效液相色谱法测定丹参药材中丹参素的含量［J］. 中医药学报，2000，28(3):68.