臭氧应激大鼠肺组织水通道蛋白5的表达及分布

邓雪凤，周 沙，陈 超，陈令佳，郭 伟，李 翔

(湖南师范大学医学院应用生理研究室，湖南 长沙 410006)

近年研究表明，水分子能高速通过细胞脂质双分子层，这一现象不能简单的用单纯扩散来解释。而水通道蛋白(aquaporin，AQP)的发现为研究水的转运开辟了一条新路径。迄今为止，通过基因检测，在呼吸系统有6 种水通道蛋白表达，分别是AQP1，AQP3，AQP4，AQP5，AQP8 和AQP9［1-2］，它们在肺水转运过程中起到不可低估的作用，其中以AQP5 为最多。气道失稳态时，AQP5 表达的变化及分布鲜见报道。本研究通过臭氧攻击致气道上皮损伤，形成气道失稳态，建立气道高反应动物模型［3］，利用Western Blot，RT-PCR 和原位杂交等技术分组观察AQP5 的表达，分析明确AQP5 在气道高反应过程中的分布情况。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

氯仿、异丙醇(广州威佳)，琼脂糖(北京百晶生物)，引物合成(上海生工)，DEPC 水(鼎国生物)，大鼠APQ5 原位杂交试剂盒(武汉博士德)，兔抗鼠-AQP5 单克隆抗体(Santa Cruz 公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(康成生物公司)，逆转录试剂盒(捷瑞生物)，脱氧核糖核酸酶(TaKaRa 公司)，TEMED(上海佳合)，Trizol(北京赛博)，ECL 发光试剂盒(Pierce 公司)。

1.1.2 实验动物

健康SD 雄性大鼠14 只，体重210 ±20g，由中南大学动物实验部提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和模型制备

14 只SD 大鼠随机分为2 组:正常对照组;臭氧应激组;每组7 只。正常对照组:每天置于空气流通的笼中饲养;臭氧应激组:每天吸入2.0ppm 臭氧与新鲜空气混合气1h;正常对照组和臭氧应激组共计饲养8d，第9d，各组动物均采用股动脉放血处死，取右肺组织约10mg，用去除RNA 酶的小剪刀在Trizol中剪碎，冻存到－70℃以备检测。

1.2.2 荧光定量RT-PCR 检测各组肺组织AQP5 mRNA 的表达

参考Trizol 试剂说明提取各组肺组织总RNA，取2μl RNA 进行琼脂糖电泳，确定其完整性;按逆转录试剂盒操作说明合成cDNA，其中2μl cDNA 为模板扩增，使用Primer Express 5.0 软件设计引物。β-actin 为内参照，上游引物:5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3';下游引物:5'-TG GATGCCACAGGATTCCAT-3';AQP5 的上游引物5'-GCGCTCAGCAACAACACAAC-3';AQP5 的下游引物5'-GTGTGACCGACAAGCCAATG-3'，琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像分析系统分析扩增产物并拍照。

1.2.3 Western Blot 检测各组大鼠肺组织AQP5 表达

使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定各组标本的蛋白质浓度，取50μg 样品加入适量的2 × SDSPAGE 样品缓冲液，沸水煮10min，进行SDS 一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后用湿转法将蛋白质转移至PVDF 膜，置于含脱脂奶粉的TBS 封闭液封闭，室温轻轻振荡1h。封闭结束后将加入第一抗体溶液(封闭液稀释，1∶500)，去除袋内所有气泡，用封膜机封口，4℃静置过夜。后取出PVDF 膜置于一平皿中，用TBST 漂洗后再浸洗3 次，每次10min。将膜放入另一塑料袋中，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体溶液，室温轻摇1h。取出PVDF 膜用TBST 漂洗后再浸洗3 次，每次10min。最后用ECL化学发光法显影，暗室曝光冲印，用凝胶成像仪测灰度，取均值。

1.2.4 原位杂交检测AQP5 在大鼠肺组织的表达

取肺组织浸入4%多聚甲醛(PFA)中，固定2 h，不同浓度酒精脱水，浸蜡过夜，切成6μm 厚石蜡切片，切片脱蜡脱水后，30% 双氧水室温孵育10min，水洗三次，每次2 min，3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃孵育10 min，用原位杂交专用PBS 洗3 次，每次5 min，DEPC 水洗一次，3min，后将切片浸入1%多聚甲醛，室温固定10min，DEPC 水洗三次，每张玻片每个组织片滴加10 μL 预杂交液，吸取多余液体，不洗，置于20%甘油湿盒，恒温箱40℃预杂交4 h，每张切片每个组织片滴加10 μL 杂交液，恒温箱40℃杂交过夜，杂交后洗涤，37℃水温的2 ×SSC 洗涤5 min 两次，0.5 ×、0.2 ×SSC 洗涤15 min各一次，滴加封闭液，37℃孵育30 min，甩去多余液体，不洗，滴加生物素标记鼠抗地高辛抗体37℃孵育1h，原位杂交专用PBS 洗三次，每次5 min，滴加SABS，37℃孵育20 min，PBS 洗三次，每次5min，滴加生物素过氧化物氧化酶，37℃孵育20min，PBS 洗四次，每次5min，使用DAB 显色10sec 左右，苏木素复染，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片观察AQP5 在肺组织的分布。

1.3 统计学处理

数据均以mean±SD 表示，用SPSS12.0 进行统计处理。统计学方法采用成组设计的t 检验和Pearson 相关检验分析相关性，以P ＜0.05 时判定差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织AQP5 mRNA 的表达

各组样本中AQP5 mRNA 含量计算如下:目的基因量=2－ΔΔCT，ΔCT 是目的基因和看家基因的循环域值的差值。数据通过对照组进行标化。ΔΔCT=(CTtarget–CTβ-actin)实验组–(CTtarget– CTβ-actin)对照组。每个目的基因表达量因此被描述为对照组的倍数。分析数据表明:臭氧应激组AQP5 mRNA 较正常组明显下降(P ＜0.05);Western Blot 检测结果与Real-time RT-PCR 一致(见图1，图2，图3)。

图1 各组大鼠肺组织AQP5 mRNA 的表达与正常对照组比较，P ＜0.05

图2 Western Blot 检测大鼠肺组织AQP5 蛋白表达

图3 Western Blot 检测大鼠肺组织AQP5 蛋白表达与正常对照组比较，P ＜0.05

2.1 AQP5 在大鼠肺组织的表达

原位杂交为地高辛探针标记，DAB 显色，结果显示:肺泡毛细血管内皮细胞(图4A)，肺泡Ⅰ型上皮细胞(图4B)均可见AQP5 表达。

图4 原位杂交定位AQP5 在大鼠肺组织的分布(×100)

3 讨论

AQPs 是一族广泛存在于细胞膜上的持续开放的、不需要消耗能量、选择性高效转运水分子的有高度同源性的特异孔道。1992年Agre 等从红细胞膜上分离得到第一个水通道蛋白，并在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中证实其具有水通道的生理功能，从而确立了水分子是可以通过孔道转运的理论。Agre以此获得了2003年诺贝尔化学奖。自从水通道被发现以来，有关水通道蛋白结构与功能的研究取得了迅速的、系列性的进展［4-5］。研究表明，AQPs 家族在多种组织的液体转运生理和病理中发挥重要作用。深入研究水通道蛋白在机体内的生理及病理功能研究，对相关疾病的临床治疗和新型药物开发具有重要意义。

气道高反应性是指气管对各种刺激呈高度敏感状态［6］，是支气管哮喘的主要特征和诊断依据。本实验室前期研究已经证实连续吸入一定量的臭氧，可致气道上皮损伤脱落，出现气道失稳态，最终导致气道高反应性。本实验结果显示，气道高反应时，模型动物表现为行动迟缓、焦躁、鼻翼扇动、呼吸急促、喘息等症状，呼吸道粘液分泌明显增加，AQP5 的表达下调，原位杂交显示AQP5 主要分布在肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡Ⅰ型上皮细胞，这与国外研究的博莱霉素肺损伤模型或腺病毒感染模型引起的水通道蛋白减低的结果类似［7-8］。分析其原因可能为臭氧连续吸入，攻击了正常气道上皮组织，致使上皮受损，出现气道上皮失稳态，随后气道应激，分泌炎症介质、细胞因子等增加、进一步加重气道损伤，引起上皮细胞的脱落和破坏，气道基底层和粘膜下腺细胞膜暴露失去保护，使AQP5 表达下调。

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