共价负载阿霉素栓塞微球的制备及缓释性能研究

张猛，李旺，张亚南，王洁，倪才华

(江南大学 化学与材料工程学院 食品胶体与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

聚乙烯醇是一种水溶性高分子材料，无毒无害、无刺激性、有良好的生物相容性［1］，被广泛用作医用材料，它的用处之一是作为血管栓塞剂用于肿瘤治疗。动脉栓塞技术是选择性地将栓塞剂注入病变靶区供血动脉、阻断血流，以达到治疗恶性肿瘤的目的［2-3］。有关栓塞微球的研究已有许多报道［4-5］。普通的栓塞微球不载药，在治疗癌症的过程中需要的周期较长。而载药栓塞微球除了物理栓塞作用外，还具有向靶向部位释放药物的功能，因而可以提高治疗效果，降低普通化疗药物的毒副作用。

目前已知的载药栓塞微球多是把抗癌药物直接包埋于微球之中［6-7］，这样既造成了合成过程中的药物浪费，又不利于载药微球的长期保存。故设计一种便于保存、负载药物能力强的血管栓塞剂成为必然。本研究选择PVA 为主体材料，首先将其制备成粒径合适的微球，然后通过微球表面反应，使其带上酰肼基团［8-9］，得到功能化的PVA 微球。阿霉素分子中的羰基能与肼基反应生成腙，腙键可以断裂，并释放出药物。期望通过这种设计达到栓塞微球在被使用前快速共价负载药物的目的，从而避免在存放过程中的药物流失。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

0588 聚乙烯醇，工业品;石蜡油，化学纯;司班80、36%甲醛溶液、丁二酸酐、80%水合肼均为分析纯;盐酸阿霉素，上海灏云化工科技有限公司。

Nicolet 6700 全反射傅里叶红外光谱仪;VHX-1000C 超景深三维显微镜;UV2450 紫外分光光度计。

1.2 实验方法

功能化PVA 微球的合成及药物负载路线如下:

图1 聚乙烯醇(PVA)微球的药物负载示意图Fig.1 Process of polyvinyl alcohol microspheres loading drugs

合成机理:通过对交联聚乙烯醇微球(CPVA)上的羟基(—OH)进行修饰改性，引入酰肼基团;酰肼可以与阿霉素中的羰基键共价结合生成腙键，从而达到共价负载阿霉素的目的。

1.2.1 PVA 微球的制备 在250 mL 的烧杯中加入50 mL 石蜡油，机械搅拌下依次滴加1.50 g 司班80 和10 mL PVA(15%)，30 min 后滴加0.8 g 甲醛溶液和1.0 mL 盐酸，反应3 h。用乙醇破乳，洗涤，真空干燥后即可得到CPVA 微球［10］。

1.2.2 微球表面的功能化 取3.0 g 丁二酸酐和0.8 g 的二甲基氨基吡啶(DMAP)在机械搅拌下加入到50 mL 吡啶溶液中，待完全溶解后加入CPVA微球，反应10 h。过滤、乙醇洗涤，干燥至恒重。

在三口烧瓶中加入上述微球和27.6 g 乙醇，磁力搅拌下依次加入25 mL 环己烷、3.0 g 一水合硫酸氢钠，于70 ℃下反应6 h。加入饱和碳酸氢钠溶液中和，过滤、乙醇洗涤并真空干燥。

在烧杯中加入乙酯化的上述微球和80 mL 乙醇、12 g 水合肼(80%)，于40 ℃反应5 h。过滤、真空干燥，即得表面酰肼功能化的PVA 微球。

1.2. 3 栓塞微球的载药及释放 配制50 mL 0.2 mg/mL 的阿霉素溶液，调节pH 值至中性后，加入改性PVA 微球，常温下反应24 h，经过滤、冷冻干燥即得到载药微球。

称取150 mg 的载药微球，分成等量的5 份，分别放入pH 值为4.0，5.0，6.0，7.0 和7.4 的PBS 溶液中，进行药物释放。在不同的时间点用紫外分光光度计测量溶液中阿霉素(DOX)的含量。

2 结果与讨论

2.1 微球合成条件探讨

在合成微球的过程中，交联剂的加入量会影响微球的形状和性能。当甲醛加入量为0.8 g 时，微球分散均匀、外观圆整且相互之间不粘连(图2a);而当甲醛加入量为0.7 g 时，微球之间就会出现粘连且有块状物生成(图2b)，这是由于聚乙烯醇中的羟基交联反应的量过少，导致其强度无法维持微球的形状和性能。

图2 PVA 栓塞微球形貌图Fig.2 Images of PVA embolic microspheres

2.2 红外谱图

由图3 可知，在b 和c 中出现较强的羰基伸缩振动吸收峰1 750 cm－1，而在未功能化到PVA 中，此峰较弱，只有原料中极少量未醇解的羰基峰。同时，3 000 ～3 300 cm－1之间的弱峰是酰胺中N—H特征吸收峰，这一结果确证PVA 表面增加了功能基团。再对比b 和c 谱图:c 中2 960，3 300 cm－1处的尖峰是腙键和阿霉素中胺基的特征吸收峰，同时在1 600 ～1 750 cm－1之间出现的多个弱峰，是阿霉素中不同羰基的特征吸收峰，表明双键的存在，由此也证明了阿霉素的成功载入。

图3 微球的红外谱图Fig.3 FTIR of microspheres

2.3 形貌分析

图2c，d 分别是负载阿霉素前后的PVA 微球照片。对比两照片可以看出载药后的微球表面颜色明显加深，微球表面也相对比较粗糙，这是微球接枝改性和载入阿霉素所导致的结果。

2.4 粒径分析

研究了油水比对微球的粒径影响。在光学显微镜下，随机测量500 个微球的直径，结果见表1。

表1 不同条件下微球的分布情况Table 1 Distribution of microspheres under different conditions

由表1 可知，分散相(油)的体积比例越大，得到的微球粒径越小。

选用油水比为5∶1 时得到的微球作粒径分布分析，结果见图4。

图4 微球的粒径分布图(油水比为5∶1)Fig.4 Image of particle size distribution

由图4 可知，微球粒径基本上分布在100 ～700 μm 之间，最大分布在350 μm 左右。

2.5 控制释放

载药后的溶液药物经紫外分析得到:包封率=负载的药物质量/药物加入总质量=61%;载药率=负载的药物质量/微球质量=4.7%。每毫升微球约700 mg，按毫升计量:每毫升微球的载阿霉素的量为32.9 mg。按照普通分子运动机理分析，阿霉素分子会在微球浸泡过程中扩散入其中，但是考虑到交联聚乙烯醇微球的自身特性以及本研究中在短短24 h 之内负载如此高的药物量，绝不是普通的单一物理负载所能相较，这也正是化学共价负载的优势所在。

图5 是共价负载阿霉素栓塞微球在不同pH 的PBS 缓冲溶液中对阿霉素的释放图。

图5 载药微球对阿霉素在不同pH 值条件下的累计释放图Fig.5 Release profile of DOX from drug-loaded microspheres at different pH values

由图5 可知，随着pH 值的降低，载药微球对阿霉素的释放速度越快，且释放量也越多。这一趋势是腙键在酸性条件下断裂结果，且在72 h 内基本完成了对阿霉素的释放。

3 结论

采用反向悬浮聚合的方法制备出球形度良好的交联聚乙烯醇微球。通过微球表面羟基与乙酸酐反应，并依次经过酯化、酰肼化后，得到功能化栓塞微球。该微球可快速共价负载阿霉素。随着介质pH的降低，阿霉素的释放速度加快、累计释放量增大。

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