2种方法从大鼠晶状体中提取总RNA及评测

徐洪卫，张晨光，金 磊

(1.徐州医学院临床学院，江苏徐州221004;2.徐州医学院医学生物化学与分子生物学教学实验中心，江苏徐州221004)

分子生物学技术已经渗透到医学科研的各个领域，在分子生物学技术中，总RNA的提取是一项基础性工作，能否获得高质量的RNA，是决定后续试验成败的关键因素之一［1－2］。TrizoI法提取总RNA是一种传统经典的方法，目前广泛运用于分子生物学试验，其原理是TrizoI中的异硫氰酸胍可使核蛋白体裂解，使RNA与蛋白质分离，释放入液相，而氯仿可提取TrizoI中苯酚，从而使苯酚中总RNA进入水相，经离心、纯化得到总RNA［3］，而UNIQ-10柱式总RNA抽提法(以下简称柱式法)主要利用碱基配对原理，采用寡聚T结构作为亲和柱材料，当总RNA流经寡聚T柱时，RNA即被特异结合到柱子上，从而达到分离提取的目的［4］。笔者采用柱式法与Trizol法分别从大鼠晶状体中提取总RNA，使用NanaDrop2000测定其浓度及A260/A280、A260/A230，琼脂糖凝胶电泳技术分析提纯样品，反转录聚合酶链反应(RT-PCR，以下简称RT-PCR)检测是否可用于下游试验［5－6］，客观评述此2种方法优缺点，为科研及教学提供合适的总RNA抽提方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。将大鼠断头处死，取出晶状体置于无菌、无核酶1.5 ml离心管中，于－80℃冻存。

1.2 主要仪器 小型高速离心机、电子天平、高压灭菌锅、电子天平、电泳槽、超净工作台、NanaDrop2000、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪等。

1.3 试剂及配制 ①1 kb DNA ladder购买于NEB公司，RT-PCR System、agarose购买于promega公司，UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒、Trizol总RNA抽提试剂盒、特异性引物购买于生工(上海)生物工程有限公司，无水乙醇、氯仿、异丙醇均为国产试剂。②1%DEPC:DEPC 1 ml，加入1 L灭菌蒸馏水中，剧烈振荡后室温静置数小时。③TBE缓冲液:称取Tris12.1 g，硼酸5.3 g，DETA 0.74 g，溶于蒸馏水中，再定溶至1 000 ml。④试剂分装:无水乙醇、氯仿、异丙醇按照2 ml分装至无菌、无核酶EP管中。

1.4 试验方法

1.4.1 柱式法抽提总RNA。将冻存于－80℃的大鼠晶状体取出(约50 mg)，转移至无菌匀浆器中，立即加入450 μl RLT Solution，手动匀浆处理，匀浆时间不超过1 min。其余标准操作步骤参见操作手册。

1.4.2 Trizol法抽提总RNA。将冻存于－80℃的大鼠晶状体取出(约50 mg)，转移至无菌匀浆器中，立即加入1 ml TotalRNAExtractor，手动匀浆处理，匀浆时间不超过1 min。其余标准操作步骤参见操作手册。

1.4.3 RNA的琼脂糖凝胶电泳。①电泳RNA所用器械:凝胶槽、梳子、电泳槽等经常规洗净后，用乙醇脱水，再浸泡于3%H2O2溶液中10 min，然后用0.1%DEPC处理水彻底冲洗，室温晾干备用。②1×TBE缓冲液、上样缓冲液用经DEPC处理过的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22 μm滤器过滤除菌。③用1×TBE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，GelRed(10000×)加入凝胶中混匀再倒胶至凝胶槽中制胶。④制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入1×TBE，液面淹没过胶1～2 mm。⑤电泳电压2.5 V/cm，时间30 min，紫外灯下观察结果并进行拍照。

1.4.4 一步法RT-PCR。反应体系:用50 μl RT-PCR体系，RNA 模版加入 3 μl，特异性引物浓度 1 μmol/L，dATP、dTTP、dGTP、dCTP浓度各为2 μmol/L，反转录酶与DNA聚合酶均为2.5 U。反应条件:反转录48℃ 45 min，预变性94℃ 2 min;变性94℃ 1 min、退火58℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，25个循环;最后延伸为72℃ 5 min。

2 结果与分析

2.1 柱式法及Trizol法抽提总RNA结果 使用柱式法及Trizol法提取总RNA结果见图1。由图1可知，28S和18S亚基清晰可见，RNA降解较少，用NanaDrop2000测定RNA浓度，A260/A280、A260/A230结果见表1。由表1可知，柱式法A260/A280、A260/A230均在1.8 ～2.0，说明蛋白质及碳水化合物的污染较少。而使用Trizol法提取总RNA降解较多，其中28S亚基检测不到，A260/A230很低说明在提取过程中受到了污染或者是苯酚及乙醇残留。电泳最前端可见较多降解条带。

图1 总RNA抽提结果

表1 2种方法提纯RNA结果

2.2 RT-PCR 分别使用柱式法及Trizol法抽提的总RNA为模板，RT-PCR方法构建大鼠晶状体蛋白βB2，RT-PCR系统中除模板不同，其余成分完全一致，琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。由图2可知，使用柱式法抽提的总RNA为模板进行的RT-PCR反应有一清晰可见的亮带，其大小与目的基因大小(711 bp)吻合，证明是目的基因。而使用Trizol抽提的总RNA为模板进行的RT-PCR反应无结果，说明此模板不能进行RTPCR试验。这与之前分析的总RNA质量相吻合。

3 讨论

图2 RT-PCR结果

Trizol法提取总RNA耗时稍长，约70 min，需要冷冻离心机，部分操作过程需要在冰浴中切，容易受到苯酚污染及乙醇残留，因此对操作要求较高，但Trizol法提取大量样本时较为方便，适合大量样本的总RNA提取，且可以将总RNA保存在纯化的中间步骤乙醇中，待试验需要时再进一步纯化，对于样品的存储较为有利，存储时间更长。柱式法提取总RNA对于试验条件的要求相对较低，操作简便，耗时短，约40 min，全程可在常温下进行，不需要冷冻离心机，样品纯度较高，不易受到苯酚污染及乙醇残留，但如果需要提取大量样品，则需要使用多只纯化柱分别操作，给操作带来很大不便。

总RNA提取极易受到操作方法不当及外部环境的影响而发生降解［7－9］，造成RNA降解的原因来自内因和外因2个方面。内因是细胞破碎瞬间内部RNA酶释放对RNA的降解作用。外因是生物体内和外部环境中存在大量RNA酶，且RNA酶不易失活，高温后仍能正确折叠恢复活性［10］。因此从样品的储存、RNA的提取以及RNA提取完成后的保存，都需要充分准备，防止RNA酶对RNA的降解。在具体试验过程中，需要注意两点，其一，抑制外源性RNA酶活性，在操作过程中创造一个无RNA酶的环境，对操作过程中所有试验材料进行彻底处理，灭活RNA酶。其二，抑制内源性RNA酶活性，使用RNA酶特异性抑制剂如巯基乙醇等，RNA酶抑制剂对其他核酸工具酶无影响，其中关键操作步骤在于匀浆是否快速、彻底。

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