鹅肉发酵香肠菌种发酵性能与应用研究

王志威 吴素娟 李先保

（安徽科技学院食品药品学院，安徽 凤阳 233100）

WANG Zhi-wei WU Su-juanLI Xian-bao

鹅肉发酵香肠是指将鹅肉、猪背脂绞碎，加入盐、糖、发酵菌种及香辛料等辅料，均匀混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的风味独特、香味浓郁的发酵肉制品［1］。生产鹅肉发酵香肠的关键工艺是发酵剂的筛选和使用，发酵剂不仅保证了最终发酵成品的质量安全性和稳定性，而且决定了香肠的独特风味［2］。Maijala等［3］的研究结果表明，制备西式发酵香肠时，采用乳酸杆菌和微球菌混合发酵的效果比采用单一乳酸杆菌的好。中式发酵香肠若采用混合发酵菌种，生产出的产品其风味也更优［4］。此外，不同发酵剂对内源菌群的影响作用不一致，一些发酵剂在发酵过程中会产生细菌素，通常可以抑制与之相似的微生物［5］。有研究［6］认为，2种乳酸菌混合培养过程中产生的细菌素，导致其互相抑制，影响香肠的发酵效果。

本研究在吸收西式发酵肉制品技术的基础上，拟通过对植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌3种菌种的发酵性能分析，选出2种符合鹅肉发酵香肠发酵的发酵剂，并通过正交试验确定复合发酵剂的最优配比，从而制备出外观、组织状态、风味较好的鹅肉香肠，并对鹅肉发酵香肠成熟过程和贮藏过程中的pH值和感官品质等方面进行综合分析。旨在为肉鹅养殖及深加工技术的产业化提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 原辅料

鹅肉、猪肉肥膘、白胡椒粉、味精、五香粉、淀粉：凤阳市售；

乙醇、NaNO2、NaCl、Vc、蔗糖、葡萄糖：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

木瓜蛋白酶：20万U/g，南宁庞博生物工程有限公司；

嗜酸 乳 杆 菌 （Lactobacillusacidophilus，La）：编 号11073，中科院微生物所提供；

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，Lp）：编号11016，中科院微生物所提供；

戊糖 片 球 菌 （Pediococcuspentosaceus，Pp）：编 号CICC23189，中科院微生物所提供；

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：安徽科技学院食品药品学院微生物实验室提供；

无菌生理盐水（用于对菌种冻干粉的活化）：称取8.5g氯化钠加入到1 000mL蒸馏水中，在121℃下高压灭菌1 5min；

MRS固体培养基［7］（用于菌种的培养和乳酸菌总数测定）：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵1.5g，葡萄糖2 0g，吐温80lmL，MgSO4·7H2O 0.6g，琼脂15g，蒸馏水1 000mL，pH 值6.2～6.4；

MRS液体培养基［8］：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵1.5g，葡萄糖2 0g，吐温80lmL，MgSO4·7H2O 0.6g，蒸馏水1 000mL，pH值6.2～6.8。

1.2 仪器与设备

精密pH酸度计：PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司；

斩拌机：CH-3508型，常熟凯博不锈钢设备制造有限公司；

绞肉机：M12S型，沈阳厚地实业有限公司；

电子精密天平：JA61001型，上海精密科学仪器有限公司；

电热恒温培养箱：HH.B11600型，上海跃进医疗器械厂；

分析天平：FA2104N型，上海跃进医疗器械厂；

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：SYQ-DSX-280B型，上海申安医疗机械厂；

可见分光光度计：V-5000型，上海元析仪器有限公司；

立式压力蒸汽杀菌锅：LS-B0L型，科大创新股份有限公司；

低速离心机：KDC-40型，科大创新股份中佳分公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化 植物乳杆菌的活化［9］：在无菌条件下，用接种环将冻干粉菌种接种于灭菌后的MRS斜面培养上，在37℃下培养48h；用斜面上长出的菌种接种于MRS培养基上，于37℃培养48h；再次重复操作，直到长出的菌种生长良好为止，完成菌种的活化。戊糖片球菌和嗜酸乳杆菌的活化方法同植物乳杆菌。

1.3.2 菌种发酵性能测定

（1）耐食盐能力的测定：采用添加了0，2，4，6，8g/L NaCl的液体MRS培养基，分别接入Lp、La、Pp 3种菌种，于3 6℃恒温培养24h，600nm波长处测定相应的吸光度值［10］。

（2）耐亚硝酸盐能力的测定：将3种菌种分别接种到添加有0，50，100，150mg/kg亚硝酸盐含量的液体 MRS培养基，于3 6℃恒温培养24h，600nm波长处测定吸光度值，以判断3种菌种的存活情况［6］。

（3）产粘性的测定：用10g/L蔗糖代替葡萄糖制作MRS固体培养基，将植物乳杆菌、戊糖片球菌和嗜酸乳杆菌3种菌种分别接种于该培养基上，同时作为对比，将这3种菌种分别接种于含有10g/L葡萄糖的 MRS培养基上，于3 6℃恒温培养24h，用接种针挑起菌落直接观察其产粘性［11］。

（4）拮抗性的测定：在固体MRS培养基上对其中一种菌种进行划线接种，于3 6℃恒温培养24h，观察菌落生长情况，并测出其菌落总数。

（5）蛋白质降解能力的测定：将1mL菌悬液涂布于加有15%脱脂乳的MRS固体培养基中，于3 6℃恒温培养2 4h，通过菌落周围的透明圈状况来判定菌种蛋白质降解能力［12］。

（6）不同温度生长能力的测定：将3种菌种分别接种于液体 MRS培养基中，分别在5，15，25，35，45℃下恒温培养24h，同时把液体 MRS培养基作为空白对照组，于600nm下测定菌液的吸光度值。

（7）抑菌能力的测定：将待测菌株接种到 MRS液体培养基中，于3 6℃恒温培养48h，离心法取得发酵上清液，然后用牛津杯法测定各菌株发酵液的抑菌活性。牛津杯法的操作：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布于基础培养基上，将经灭菌的牛津杯间隔放置在指示菌平板上。首先向各个牛津杯中分别滴加200μL的乳杆菌发酵上清液，然后将混合菌液以1∶1（V∶V）的比例滴加到各牛津杯中，于3 6℃恒温培养24h后取出，测量各抑菌圈直径的大小［13］。

1.3.3 鹅肉发酵香肠的工艺流程

1.3.4 单因素试验设计

（1）菌种配比的影响：根据菌种发酵性能测定结果并考虑经济、操作方便等因素，在此次试验中从3种菌种中选出植物乳杆菌和戊糖片球菌作为复合发酵剂。有研究［14］表明，菌种配比对香肠的酸度影响较小，但是对香肠风味影响很大，所以在此次试验中主要是选择产生良好风味的发酵剂配比。本试验选取发酵温度3 6℃，发酵时间24h，对植物乳杆菌和戊糖片球菌的复合配比进行两因素三水平的试验，并对产品进行感官评价。

（2）发酵时间的影响：在混合菌种（Lp∶Pp）配比1∶1（V∶V），接种量3%（V/m），发酵温度3 6℃的条件下，发酵时间分别选择6，12，18，24，30h进行试验，测量香肠的p H值。

（3）混合菌种接种量的影响：在混合菌种（Lp∶Pp）配比1∶1（V∶V），发酵温度36℃，发酵时间24h的条件下，接种量（V/m）分别选择1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%（菌体细胞的浓度是107CFU/mL）进行试验，从发酵开始每隔6h对每一接种量的香肠的pH值进行测定。

（4）发酵温度的影响：在混合菌种（L p∶Pp）配比1∶1（V∶V），接种量为3%（V/m）的条件下，分别于27，30，33，36，40℃发酵36h，从发酵开始每隔6h对每一温度下的香肠的pH值进行测定［8］。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 pH值的测定 取发酵香肠内容物10g，捣碎后加入90mL蒸馏水，震荡浸提20min后提取上清液，用精密pH计测定pH值。

1.4.2 菌落总数 按GB 4789.2—2010《食品卫生微生物检验菌落总数测定》中的平板计数法执行。

1.4.3 感官评分 由10名有感官评分经验的教师组成评定小组，按照外观、组织状态、风味，逐一对发酵香肠进行评价打分，其标准见表1［9］。

表1 香肠感官评价标准Table 1 Fermented sausage sensual evaluation standard

2 结果与分析

2.1 菌种发酵性能的试验结果

2.1.1 耐食盐性测定结果 在发酵香肠的加工中，食盐有防腐保鲜、调味及提高保水性等作用。有研究［6］表明，一定的食盐浓度能抑制腐败菌的生长，减少对蛋白质的分解。食盐浓度对发酵香肠的发酵有显著的影响，一般发酵剂要求其耐盐性达到6%［15］。本研究以菌种在液体培养基中吸光值的变化，研究其耐食盐性，结果见表2。

由表2可知，3种菌种均受食盐含量变化的影响，食盐浓度增加，菌种的生长受到抑制，吸光值变小。其中嗜酸乳杆菌的吸光值随食盐浓度的增加变化大，而植物乳杆菌和戊糖片球菌的变化相对较小。说明嗜酸乳杆菌的耐盐能力低于植物乳杆菌和戊糖片球菌。

表2 不同食盐浓度下各菌种的吸光度值Table 2 Absorbency value of various strains in different salt concentrations

2.1.2 耐亚硝酸盐性测定结果 在发酵香肠的加工中，加入亚硝酸盐可以增强产品风味和色泽，抑制细菌的增殖，对肉毒梭状芽孢杆菌抑制作用明显，保证制品的微生物安全性。发酵香肠生产所选的发酵剂一般要求可耐100mg/kg的亚硝酸浓度，否则会抑制发酵菌种的发酵性能，且成品中的亚硝酸盐残留量也会增加，影响发酵香肠的安全性［16］。本研究以吸光值的变化作为菌种的生长指标，研究菌种的耐亚硝酸盐性，结果见表3。

表3 不同亚硝酸钠浓度下各菌种的吸光度值Table 3 Absorbency value of various strains in different sodium nitrate concentrations

由表3可知，随着亚硝酸钠浓度的增加，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和戊糖片球菌的生长均受到不同程度的抑制。其中嗜酸乳杆菌的吸光度值随亚硝酸盐浓度的增加而变化明显，植物乳杆菌和戊糖片球菌的变化相对缓慢。由此可知，嗜酸乳杆菌的耐亚硝酸盐性低于戊糖片球菌和植物乳杆菌。

2.1.3 产粘性试验测定结果 在香肠发酵过程中，不能产生黏液，否则会破坏发酵香肠的内部组织结构。通过观察培养基培养情况（见表4）可以发现，3种菌的产粘性相对都很低，但是嗜酸乳杆菌的菌体出现流体状的情况比其他2种菌的严重一些，表明3种菌种均符合发酵香肠的发酵要求，其中植物乳杆菌和戊糖片球菌更加适合。

2.1.4 拮抗性试验测定结果 本研究以单个菌种和两两混合的菌种（1∶1，V∶V）在培养基上划线培养观察其菌落总数来判断其拮抗性，结果见表5。

表4 各菌种产粘性结果Table 4 The result of different strains for glischrogenou

由表5可知，3种菌种单独培养24h后菌种数量均有所增长，两两混合菌种培养后的菌落数量相对单个菌种培养的菌落总数变化不大。由此可知，3种菌种之间两两的拮抗性不大，其中植物乳杆菌和戊糖片球菌的组合相对较好。因此，植物乳杆菌和戊糖片球菌可以作为发酵香肠的混合发酵剂。

2.1.5 蛋白质分解试验测定结果 发酵香肠的生产中，要求蛋白质分解只在其内源蛋白酶的作用下降解产生多肽、氨基酸及风味物质，发酵剂应不具有降解蛋白质的作用。若发酵剂具有降解蛋白质的能力，则会在生产贮藏销售中产生胺类等碱性物质，导致腐败［17，18］。本研究用加入脱脂乳的培养基培养24h，观察其降解蛋白质的能力，结果见表6。由表6可知，植物乳杆菌菌落周围无透明光圈，嗜酸乳杆菌和戊糖片球菌菌落周围的光圈不明显。因此，3种菌种均符合发酵香肠的生产要求。

表6 各菌种蛋白质分解能力试验结果Table 6 The result of different strains for protein decomposing ability

2.1.6 菌株不同温度下的生长能力测定结果 低温发酵香肠发酵温度一般为18～24℃，高温发酵香肠发酵温度一般为28～36℃［15］。这就要求菌种要选择适当的生长温度。由图1可知，在不同的温度条件下培养，菌种的生长速度有较大的差异，随着温度的增加，其生长速度逐渐增加，当温度在35℃时，生长速度最快。由此可知，35℃左右是最适合3种菌种生长的温度。

2.1.7 菌种抑菌能力的测定结果 发酵香肠以生肉为原料，且多为生食，在发酵过程中残留有致病菌和腐败菌在所难免。其主要的致病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。本研究分别测定了3种菌种及两两混合菌种（1∶1，V∶V）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力，结果见表7。

图1 3种菌不同温度下的生长能力Figure 1 Growth ability of three kinds strains in different temperature

表7 乳酸菌的抑菌活性Table 7 Antibacterial circle diameter in tactic acid bacteria activity /mm

由表7可知，嗜酸乳杆菌的抑菌能力明显低于其他2种菌；植物乳杆菌和戊糖乳杆菌混合菌液的抑菌效果优于其他2种混合菌液及单一菌液。根据耐盐、耐亚硝酸盐和粘性试验的结果，选择植物乳杆菌和戊糖片球菌混合菌种作为鹅肉发酵香肠的发酵剂。

2.2 菌种最优配比试验结果

在发酵初期植物乳杆菌大量繁殖产生乳酸，香肠的pH值下降较快，影响戊糖片球菌的繁殖；发酵后期戊糖片球菌能够更好的生长，并分解蛋白质和脂肪，产生氨基酸和脂肪酸，赋予香肠良好的风味［4］。为了考察植物乳杆菌和戊糖片球菌的交互作用对发酵香肠感官评价的影响，并确定二者的最优配比，设计了两因素三水平的试验，结果见表8、9。

由表8可知，随着植物乳杆菌添加量的增加，感官评分呈下降趋势；而随着戊糖片球菌添加量的增加，香肠的风味渐佳，有利于鹅肉发酵香肠质量的改善。因此确定混合发酵剂的最优配比是最终在植物乳杆菌和戊糖片球菌以1∶1（V∶V）的比例混合，接种量为3%。此配比下生产的发酵香肠的质地柔软有弹性，切片性较好，而且颜色鲜红，酸味柔和，口感达到最佳。

由表9可知，植物乳杆菌和戊糖片球菌对鹅肉发酵香肠的感官评价均有显著影响，此外，二者之间的交互作用所产生的效应对鹅肉发酵香肠的感官评价也在0.01水平上影响显著，所以应充分考虑二者相互作用产生的效应对产量的影响，寻找两因素的最佳组合。

表8 菌种配比对香肠品质影响的试验设计及结果Table 8 Different strains ratio on the sausage-quality experimental design and results（n＝3）

表9 方差分析表Table 9 ANOVA table

表9 方差分析表Table 9 ANOVA table

误差项及交互项参考文献［19］的方法确定。

差异源 平方和 自由度 均方差 F值 F临界值显著水平植物乳杆菌 78 2 39 8.775 F0.01＝6.01 显著戊糖片球菌 666 2 333 74.925 F0.01＝6.01显著交互 1 614 4 403.5 90.7 875 F0.01＝4.58显著误差80 18 4.444 444总计2 438 26

2.3 菌种在发酵过程中相关因素的确定

2.3.1 发酵时间的确定 由图2可知，鹅肉发酵香肠接种后，其pH值开始下降，在0～12h，pH值的下降速度较慢，在12～24hpH下降的速度较快，发酵24h后，其pH值趋于稳定。此时香肠pH值为4.87，符合发酵香肠的pH标准，再延长发酵时间会增加生产成本。因此，发酵时间选择为24h。

图2 发酵时间对发酵香肠pH值的影响Figure 2 Effect of fermentation time on pH value of goose sausage

2.3.2 发酵温度的确定 发酵温度的选择关系到混合发酵菌种及肠内各类微生物的生长竞争和平衡。由于发酵香肠的原材料未经杀菌处理，为了保证发酵安全，应该迅速使发酵剂成长为优势菌种，以产生乳酸，降低pH值，抑制杂菌生成。

图3显示了发酵香肠在不同温度下的产酸速度。在较高的温度（39℃）时，产品发酵速度快，但肠体渗油现象比较明显。而在较低的温度（27，30，33℃）时，产酸速度较慢，发酵周期长，易引起其他杂菌的生长。而在36℃发酵时，发酵得到的产品酸度适中，故选择36℃作为发酵温度。

图3 发酵温度对发酵香肠pH值的影响Figure 3 Effect of fermentation temperature on pH value of goose sausage

2.3.3 菌种接种量的确定 由图4可知，发酵菌种的接种量与产酸速度正相关，即发酵菌种接种量越大，产酸速度越快，这与李俊芳等［20］的研究结果一致。但是接种量过大（4%，5%，V/m）时，pH值会快速下降到较低值，使得短时间内由于肠内积累了大量的酸，且分布不够均匀，使得肠的酸味刺激性较大，香味也不够充足。而接种量过小（1%，2%，V/m）时，不仅产品的发酵周期较长，而且在发酵初期易受其他杂菌的污染。所以，接种量在3%（V/m）出现最佳值。

3 结论

图4 接种量对发酵香肠pH值的影响Figure 4 Effect of inoculum quantity on pH value of goose sausage

从耐食盐、耐亚硝酸盐性、是否产粘性、菌种之间是否有拮抗性，蛋白质的分解能力和菌种的抑菌能力方面对菌种发酵性能方面进行研究，从而确定植物乳杆菌和戊糖片球菌组成的混合发酵剂是鹅肉发酵香肠的最优发酵剂，二者按1∶1（V∶V）配比、接种量为3%（V/m）、在36℃恒温发酵2 4h的条件下制成的鹅肉发酵香肠的pH值和水分活度均达到所需的要求，且呈现出质地柔软富有弹性、切片性好、颜色红润、酸味柔和、口味上乘的品质。此外，随着接种乳酸菌的发酵，香肠pH值迅速下降，使得有害杂菌的生产和繁殖受到显著抑制，从而提升了鹅肉发酵香肠的安全性和稳定性。

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