苦苣多酚超声辅助提取及抗氧化研究

金寒冰 方 丽 赖蓓蕾 吴祥庭

（温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州 325027）

苦苣为草本植物，系菊科，苦苣菜属，在中国分布广泛，资源丰富［1］。苦苣是营养丰富的中药材，可全株入药，味苦、性寒，可用于治疗急性痢疾、肠炎、痔疮肿痛等症状［2］。苦苣提取物具有明显的抗炎、抗凝血作用、抗氧化性和抗肿瘤的作用［3］；苦苣的多酚类化合物的含量也是相当丰富［4］。目前国内外苦苣多酚提取工艺及抗氧化活性未见报道。本研究拟在传统的回流浸提基础上，加以超声波辅助提取以提高多酚的提取率，通过单因素和二次回归正交旋转组合法优化提取苦苣中多酚的工艺条件，再对苦苣多酚提取液进行抗氧化活性的测定，为开发利用苦苣资源和生产多酚制品提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

苦苣：干品（水分＜0.5%），购于温州农贸市场，粉碎后过50目筛，得到苦苣粉末备用；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：分析纯，美国Sigma公司；

没食子酸标准品：分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司；

2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）：分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司；

乙醇、三氯甲烷、冰乙酸、铁氰化钾、三氯化铁、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧水和三氯乙酸：分析纯，无锡市佳妮化工有限公司；

VC：分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

数显水浴锅：HH-S型，巩义市英峪予华仪器厂；

数显智能控温磁力搅拌器：SZCL-2B型，郑州长城科工贸有限公司；

微电脑智能化控制恒温干燥箱：101-2型，宁波莱福科技有限公司；

台式低速离心机：80-2型，上海医疗器械有限公司；可见分光光度计：UV-722型，上海欣茂仪器有限公司；循环水式多用真空泵：SHZ-Ⅲ型，上海亚荣生化仪器厂；

超声波细胞粉碎机：JY92-ⅡDN型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制

（1）没食子酸标准液配制：精确称取0.070g的干燥没食子酸标准品，用蒸馏水溶解，定容于100mL的容量瓶中，配成浓度为700mg/L的没食子酸溶液。

（2）福林（Folin-Ciocalteu）试剂的配制：在250mL磨口回流瓶中加入20g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），5g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及140mL蒸馏水，再加10mL 85%磷酸，20mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10h。回流结束时，加入30g硫酸锂（Li2SO4），10mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，以便去除过量的溴，冷却后溶液呈黄色，稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。

（3）0.01mmol/L DPPH·溶液的配制：精确称取0.198 4g DPPH·用无水乙醇溶解，定容于50mL容量瓶，摇匀，作为储备液保存于冰箱中。

（4）0.02mg/mL BHT溶液配制：精确称取0.5g BHT固体，用甲醇溶解，定容至50mL后从中取出1mL再用甲醇定容至50mL棕色容量瓶中。

1.2.2 标准曲线的制作 分别吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mL没食子酸标准溶液定容于50mL容量瓶内，配成浓度为0～56mg/L的系列标准溶液。再从各标准溶液中吸取1mL加入25mL容量瓶内，加10mL蒸馏水，摇匀，再加1.5mL Folin-Ciocalteu试剂，充分摇匀30s后，加入6mL 10%Na2CO3溶液，混匀后加水定容，再混匀，然后在3 0℃下避光放置反应2h，以0样为空白，在765nm的波长处测定吸光值，以吸光度值为纵坐标A，浓度为横坐标C，绘制得标准曲线线性回归方程A＝0.114 1C＋0.003 9，相关系数R2＝0.995 2。

1.2.3 苦苣多酚提取 精密称取1.000g干燥的苦苣粉末，置于250mL蒸馏瓶中，加入一定体积分数的浸提溶剂摇匀，在不同超声波功率和超声时间下进行处理，设定最高温度为60℃，取出后在水浴锅中于不同温度下回流浸提一定时间，冷却后用布氏漏斗过滤，收集滤液定容至50mL容量瓶中。

1.2.4 提取率的计算 取1mL苦苣多酚提取稀释液于2 5mL容量瓶内，加10mL蒸馏水，摇匀，再加1.5mL Folin-Ciocalteu试剂，摇匀，在放置30s后加入6mL 10%Na2CO3溶液，450s内加完，混匀，加水定容，再混匀，避光反应2h，在765nm波长处测定吸光值，根据测得的标准曲线线方程计算苦苣提取液中多酚含量（以没食子酸计），计算得多酚提取率［5］。

式中：

Y——苦苣多酚提取率，%；

C——提取原液中多酚的浓度，mg/mL；

V——提取多酚稀释液总体积，mL；

M——苦苣质量，mg。

1.2.5 苦苣多酚提取单因素试验

（1）乙醇体积分数的影响：称取1g苦苣粉5份，在液固比25∶1（V∶m），即分别加入25mL体积分数为40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液中摇匀，在超声功率2 05W下超声20min，再于65℃下浸提1 20min，并测定苦苣多酚提取率。

（2）液固比的影响：称取1g苦苣粉5份，分别加入液固比为15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1（V∶m）体积分数为70%的乙醇溶液摇匀，在超声功率2 05W下超声2 0min，再于65℃下浸提120min，并测定苦苣多酚提取率。

（3）超声功率的影响：称取1g苦苣粉5份，加入液固比为30∶1（V∶m）体积分数为70%的乙醇溶液，摇匀，分别在超声功率105，155，205，255，305W 下超声2 0min，再于6 5℃下浸提120min，并测定苦苣多酚提取率。

（4）超声时间的影响：称取1g苦苣粉5份，加入液固比为30∶1（V∶m）体积分数为70%的乙醇溶液，摇匀，在超声功率255W 下分别超声10，15，20，25，3 0min，再于6 5℃下浸提120min，并测定苦苣多酚提取率。

（5）浸提温度的影响：称取1g苦苣粉5份，在液固比为30∶1（V∶m）体积分数为70%的乙醇溶液中摇匀，在超声功率255W 下超声20min，再分别于45，55，65，75，85℃下浸提120min，并测定苦苣多酚提取率。

（6）浸提时间的影响：称取1g苦苣粉5份，在液固比为30∶1（V∶m）体积分数为70%的乙醇溶液中摇匀，在超声功率255W下超声2 0min，再于75℃下分别浸提40，80，120，160，200min，并测定苦苣多酚提取率。

1.2.6 苦苣多酚还原能力试验 在10mL离心管内加入2.5mL不同浓度苦苣多酚溶液（0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18mg/mL）与2.5mL 0.2mol/L 磷酸钠缓冲液（p H 6.6）和2.5mL 1%铁氰化钾，混合，50 ℃水浴保温2 0min后加入2.5mL 10%三氯乙酸（m/V），加盖混匀，将混和物在3 000r/min条件下离心10min，移取5.0mL上清液于试管中，再加5.0mL去离子水和1mL 0.1%三氯化铁，混合摇匀，静置10min后用分光光度计在波长700nm处测吸光度，其吸光度的大小即反映了其还原能力的强弱［6，7］，用Vc作比较。每种浓度均做3次平行试验。

1.2.7 苦苣多酚清除DPPH能力试验 分别取浓度为0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18mg/mL的苦苣多酚溶液2.0mL，加入2.0mL用无水乙醇配制的0.8mmol/L DPPH溶液，用力振摇混匀后在黑暗环境中静置3 0min，用UV-722型分光光度计于波长517nm处测定其吸光度，用Vc作比较［8］。计算DPPH清除率。

式中：

E——清除率，%；

Ax——加入样品溶液后的吸光度；

Ax0——样品溶液本底（样品＋无水乙醇）的吸光度；

A0——空白对照液（DPPH溶液＋相应溶剂）的吸光度。

1.2.8 苦苣多酚清除羟基自由基（·OH）能力试验 芬顿（Fenton）体系邻二氮菲－Fe2＋氧化法测定清除羟基自由基［9］，取1.5mL 1mmol/L 的邻二氮菲分别放入试管中，加入4.5mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液，再加入1mmol/L Fe-SO4溶液1mL，立即混匀后分别加入1mL 0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8mg/mL 的苦苣多酚液，然后加入1mL 0.1%H2O2，于37℃保温60min，536nm处测定吸光度值，以相同浓度的Vc作对比试验，按式（3）计算羟基自由基的清除率：

式中：

E——清除率，%；

Aa——加入样品溶液后的吸光度；

Ab——水替代样品和H2O2的吸光度；

A01——空白对照液（水替代样品）的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 乙醇体积分数对苦苣多酚类提取率的影响Figure 1 Effects of the solvent volume fraction on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

2.1.1 乙醇体积分数对苦苣多酚提取率的影响 由图1可知，当乙醇体积分数达到70%时，苦苣多酚的提取率最高为0.932%。乙醇浓度增加会使多酚的溶出增加，由于多酚含有酚羟基与蛋白质、多糖等以氢键形成稳定化合物，而乙醇的羟基能竞争性地与蛋白质、多糖结合，使酚羟基与蛋白质、多糖结合的氢键断裂，从而使多酚提取率提高［10］。

2.1.2 液固比对苦苣多酚提取率的影响 由图2可知，当液固比达到30∶1（V∶m）时，苦苣多酚的提取率最高为1.099%。当溶剂增大时苦苣多酚溶出量增多，当液固比达到30∶1（V∶m）后再增加溶剂的量苦苣多酚的提取率增加不多，此外液固比的增大使得乙醇用量过大而成本增加，并且增加浓缩负荷。

图2 液固比对苦苣多酚提取率的影响Figure 2 Effects of the ratio of liquid to solid on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

2.1.3 超声功率对苦苣多酚提取率的影响 由图3可知，当超声波功率达到255W时，苦苣多酚的提取率最高为0.851%。过低的超声波功率不能打破多酚与蛋白质多糖等的结合，使多酚不能很好地溶出，过高同样会破坏多酚物质的结构，使提取率降低。

2.1.4 超声时间对苦苣多酚提取率的影响 由图4可知，当超声波时间达到20min时，苦苣多酚的提取率最高为0.924%。超声波辅助提取有利于苦苣细胞更好的破碎使得细胞内多酚类化合物得以溶出，达到一定的破碎度才能有很好的提取率，当超声波时间过长时，多酚易氧化分解［11］，导致苦苣多酚的提取率反而降低。

2.1.5 浸提温度对苦苣多酚提取率的影响 由图5可知，当浸提温度达到75℃时，苦苣多酚的提取率最高为0.885%。在温度较低时，随着温度的升高，多酚类化合物在醇液中的运动速度增大，促进其从细胞中溶出，提高提取效果，而当温度超过75℃时，过高的浸提温度会破坏多酚的结构，再加上多酚在高温环境下容易发生氧化。

图3 超声功率对苦苣多酚提取率的影响Figure 3 Effects of the ultrasonic power on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

2.1.6 浸提时间对苦苣多酚提取率的影响 由图6可知，当浸提时间达到120min时，苦苣多酚的提取率最高为0.887%。提取时间太短，苦苣与提取液之间接触不够充分，苦苣细胞中多酚的溶出不完全；浸提时间过长，长时间的受热会使得部分多酚类化合物的结构遭到破坏，影响苦苣多酚提取率。

综上单因素试验选择最佳条件进行验证实验，在70%乙醇体积分数，液固比30∶1（V∶m），超声功率255W，超声时间20min，再浸提温度75℃，浸提时间2h，重复实验3次，苦苣多酚的提取率（1.040±0.09）%。

图4 超声时间对苦苣多酚提取率的影响Figure 4 Effects of the ultrasonic time on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

图5 浸提温度对苦苣多酚提取率的影响Figure 5 Effects of the extraction temperature on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.phenolics

图6 浸提时间对苦苣多酚提取率的影响Figure 6 Effects of the extraction time on the extraction rate of Sonchus oleraceus L.Phenolics

2.2 苦苣多酚抗氧化活性

2.2.1 苦苣多酚还原能力 由图7可知，从一开始苦苣多酚的还原能力就要比VC强。随着浓度的增大，苦苣多酚的还原能力增大但增大速度有所减慢。而VC的还原能力随浓度的增加而增大的幅度仍旧较快，可见，苦苣多酚的还原能力强于Vc的还原能力。

图7 不同浓度的苦苣多酚与Vc的还原能力比较Figure 7 Comparison of reducing power between different concentration polyphenol in Sonchus oleraceus and Vc

2.2.2 苦苣多酚清除DPPH能力 苦苣多酚和VC对DPPH清除效果见8。在试验浓度范围以内，不同浓度的苦苣多酚对DPPH清除率随浓度的提高而增大。当浓度大于0.09mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相当，达到半数清除率，在0.18mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率达到了80%以上，说明苦苣多酚与Vc对DPPH清除能力相当，具有较强的抗氧化活性。

2.2.3 苦苣多酚清除羟基自由基（·OH）能力 ·OH 是引起脂质过氧化、蛋白质和多糖分解的重要活性氧自由基，是体内最活泼的活性氧。由图9可知，苦苣多酚和Vc对·OH均有清除作用，且呈剂量效应关系，在浓度为0.3～1.2mg/mL时苦苣多酚对·OH清除率能力较Vc稍差，当浓度大于1.2mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相当，两者在1.2～1.5mg/mL时达到半数清除率，在1.8mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率达到了82%以上，说明苦苣多酚具有较强的抗氧化活性，在较高浓度时与Vc清除羟基自由基能力相当。

图8 不同浓度的苦苣多酚与Vc对DPPH的清除效果Figure 8 Scavenging ability of different concentration polyphenol in Sonchus oleraceus and Vc on DPPH

图9 不同浓度的苦苣多酚与Vc对羟基自由基（·OH）的清除效果Figure 9 Scavenging ability of different concentration polyphenol in Sonchus oleraceus and Vc on·OH

3 结论

（1）超声辅助提取苦苣多酚不仅提取效率高、提取时间短，而且提取成本低。在70%乙醇体积分数，液固比30∶1（V∶m），超声功率255W，超声时间20min后，再浸提温度75℃，浸提时间2h的条件下，多酚提取率为（1.040±0.09）%。

（2）试验结果表明，苦苣多酚的还原能力与其浓度成正相关性，在低于0.15mg/mL时还原力比 Vc弱，高于0.15mg/mL时还原力与Vc相当；苦苣多酚对DPPH清除率随浓度的提高而增大，当浓度大于0.09mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相当，在0.18mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率达到了80%以上；苦苣多酚和Vc对·OH均有清除作用，且呈剂量效应关系，在浓度为0.3～1.2mg/mL时苦苣多酚对·OH清除率能力较Vc稍差，当浓度大于1.2mg/mL后，苦苣多酚和Vc的清除效果相当，两者在1.2～1.5mg/mL时达到半数清除率，在1.8mg/mL苦苣多酚和Vc的清除率达到了82%以上。说明苦苣多酚具有比较强的抗氧化性，是天然的抗氧化剂。但本试验只研究了苦苣多酚体外抗氧化的部分试验，下一步将进行动物试验以探讨其在生物体内的清除自由基能力，对苦苣多酚的分子结构也有待进一步研究。

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