超声波辅助溶菌酶酶解提取地木耳蛋白质工艺优化

李 让 鲁 军 陈剑婷 袁 悦 田 漫 任迪峰

（1.北京林业大学生物科学与技术学院食品系北京市林业食品加工与安全重点实验室，北京 100083；2.中国食品发酵工业研究院北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015）

地木耳（Nostoccommune）又名地皮菜、葛仙米、地耳等，属原核生物界、蓝藻门、念珠藻属的单细胞陆生固氮蓝藻，是一种高蛋白、低脂肪的绿色食品，蛋白质含量一般占干重的14.6%～21.81%，是很好的蛋白质来源［1－3］。其组分中的藻蓝蛋白（PC），不仅可作为食品着色剂和荧光探针，同时对于自由基的清除和特异性免疫功能的提高也有促进作用，有较大的应用价值［4，5］。地木耳蛋白质中氨基酸结构比例与人体需要量相近，长期食用可提高机体免疫力［6，7］。传统的地木耳蛋白质提取方法主要有溶剂法和碱法，但因存在提取溶剂不易去除、提取率低和生产成本较高等缺点［8－10］，使得地木耳中的蛋白质尚未被充分开发利用。

从显微结构看，地木耳部分藻丝存在胶鞘包裹、细胞壁成分复杂、破壁难度较大［11］等问题。而地木耳中蛋白质主要存在于胞内，因此提取关键技术在于破壁［5］。有研究［12］采用溶菌酶添加少量纤维素酶和果胶酶进行原核藻类处理，破壁效果较好。同时一些蛋白质或多糖提取的研究［13－15］表明，采用酶解方法，再结合反复冻融温和破壁，可避免高温对原料造成营养损失等不良影响。另有研究［16－21］采用超声波辅助处理藻类或其他植物原料，利用其产生的空化及机械作用加速细胞壁的破碎，促进蛋白质溶出，提高蛋白质提取效率。

基于以上众多研究成果可以发现，整合酶解、冻融以及超声波辅助法进行植物原料的细胞破碎将是一种很好的地木耳蛋白质提取优化思路。本研究拟以蛋白质提取率为指标，结合酶解、冻融和超声波法进行细胞破碎，探究地木耳蛋白质的提取条件，并通过响应面法对提取参数进行优化，旨在为地木耳蛋白质的进一步开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

地木耳片：山西汾阳市迅达土特产品有限责任公司；

牛血清白蛋白（BSA）：生物试剂，美国Amresco公司；

考马氏亮蓝G-250：生物试剂，天津市博迪化工有限公司；

果胶酶：活力单位＞10kU/g solid，上海伊卡生物技术有限公司；

纤维素酶：活力单位为10kU/g solid，上海伊卡生物技术有限公司；

溶菌酶：活力单位＞20kU/mg，上海前尘生物科技有限公司；

液氮：中科院半导体研究所；

磷酸、乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

凯氏定氮仪：KDY-9830型，北京市通润源机电技术有限责任公司；

超声波细胞粉碎机：JAC-IV型，济宁市奥波超声波电气有限公司；

低速离心机：LD4-2型，北京医用离心机厂；

数显温控仪：XMTB型，余姚市东方电工仪器厂；

紫外可见分光光度计：725型，上海美谱达仪器有限公司；

台式恒温振荡器：TS-100B型，上海天呈实验仪器制造有限公司；

电子天平：FA2004-N型，上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 地木耳蛋白质提取工艺

地木耳干片→粉碎→80目过筛→称量→料液混匀→液氮冻融→组合酶酶解（0.1%溶菌酶、0.05%纤维素酶、0.05%果胶酶，55℃酶解1h）→灭酶（80℃，15min）→超声波处理→离心分离（4 000r/min，15min）→测定蛋白质提取率

1.3.2 地木耳总蛋白含量的测定 根据GB 5009.5—2010，采用微量凯氏定氮法测定地木耳蛋白质的总量。

1.3.3 地木耳的可溶性蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝G-250蛋白质染色法在595nm处测定可溶性蛋白质含量［22］。按式（1）计算可溶性蛋白质提取率：

1.3.4 超声波破碎条件单因素试验设计

（1）时间对地木耳蛋白质提取率的影响：料液比为1∶30（m∶V），超声功率600W，超声时间分别为10，15，20，25，30min，以可溶性蛋白质的提取率为指标，按1.3.1工艺流程测定所提取地木耳蛋白质的提取率。

（2）功率对地木耳蛋白质提取率的影响：料液比为1∶30（m∶V），超声时间25min，超声功率分别为200，400，600，800，1 000W，以可溶性蛋白质的提取率为指标，按1.3.1工艺流程测定所提取地木耳蛋白质的提取率。

（3）料液比对地木耳蛋白质提取率的影响：超声功率为800W，超声时间25min，料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（m∶V）。以可溶性蛋白质的提取率为指标，按1.3.1工艺流程测定所提取地木耳蛋白质的提取率。

1.3.5 数据分析方法 利用Design-Expert 8.0.5软件对试验数据进行处理，获得数学模型，对响应值进行回归分析、方差分析，用F检验判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，得出超声波各因素对蛋白质提取率的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取时间对蛋白质含量的影响 由图1可知，在2 5min前，随着时间的延长，溶液中的可溶性蛋白含量不断增加，说明地木耳细胞壁在超声波的反复作用下出现明显破损，细胞内蛋白质被释放出来，蛋白质肽链间被破坏的二硫键的量不断增大，直到2 5min时，达到饱和；当提取时间超过25min后，溶液中蛋白质含量呈现降低的趋势，这可能是因为随着时间的延长，产生的热量过多，导致蛋白质的稳定性降低，引起蛋白质分解。综上分析可得，较佳的提取时间为25min。

图1 提取时间对蛋白提取率的影响Figure 1 Effect of extraction time on protein content

2.1.2 提取功率对蛋白质含量的影响 由图2可知，在8 00W前，随着提取功率的增长，超声波振动空化、机械粉碎、搅拌等作用，使组织中的细胞破裂，利于溶剂渗透到细胞内，蛋白质含量逐渐增加。当提取功率超过8 00W，由于超声提取功率过大，温度迅速升高会破坏蛋白质，从而影响蛋白质提取率，使得溶液中蛋白质含量逐渐降低。综上可得，较佳的提取功率为800W。

图2 超声功率对蛋白质提取率的影响Figure 2 Effect of ultrasonic power on protein content

2.1.3 料液比的影响 料液比越大，即溶剂体积越大，则溶剂中可以容纳的有效成分越多。料液比对蛋白质提取的影响见图3，当料液比达到1∶40（m∶V）时，蛋白质含量不再继续提高，说明此时地木耳蛋白质中肽链间被破坏的二硫键的量达到最大。再增加水量，不能显著破坏肽链间的二硫键，溶液中蛋白质含量无明显变化，随着所加水量增加到一定程度，浓度过小使得摩擦破碎不完全，蛋白质浓度反而降低［23］。由图3可知，料液比1∶40（m∶V）为最佳条件。

图3 料液比对蛋白质提取率的影响Figure 3 Effect of ratio of material to liquid on protein content

2.2 响应面优化试验的设计与结果分析

2.2.1 响应面优化试验的设计 根据单因素试验结果，选取时间、功率和料液比3个因素作试验因素，以蛋白质提取率为响应值，借助Design-Expert 8.0.5Trial软件对提取条件进行分析优化，试验因素及水平见表1。

2.2.2 地木耳优化试验设计及结果 地木耳优化试验设计及结果见表2。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

表2 地木耳提取优化试验设计及结果Table 2 Optimization of fermentation conditions design and results of experimental design

2.2.3 模型的建立与显著性检验 通过Design-Expert 8.0.5统计软件进行试验数据二次多项回归拟合，获得蛋白质提取率（Y）对自变量时间、功率、料液比的多元回归方程：

对该模型进行显著性检验，结果见表3。

由表3可知，模型P＜0.01，失拟项P＝0.620 7＞0.05，说明该模型极显著，失拟项不显著，残差主要由随机误差引起；同时复相关系数R2＝0.927 8，Radj2＝0.834 9，说明该模型对试验的拟合情况良好，自变量与响应值之间线性关系显著。由此可得，应用该回归方程分析和预测试验结果具有可行性［24］。

分析表3可得出，交互项AB、BC与二次项A2、C2均达到显著水平（P＜0.05）。另外，通过F值的大小，可以推断在选定的试验范围内各因素对试验结果的重要性，F值越大，其重要性越大［25］，在所选的各因素范围内，各因素对结果的影响大小顺序为：功率＞时间＞料液比。

2.2.4 最优酶解参数的确定 Design-expert 8.0.5软件的响应面优化设计分析优化结果见图4～6。

表3 试验结果方差分析表Table 3 Test result of regression analysis

图4 提取时间超声功率对地木耳蛋白质提取率影响的响应面图Figure 4 The response surface figure about the effect of extraction time and ultrasonic poweron protein content

图5 超声功率料液比对地木耳蛋白质提取率影响的响应面图Figure 5 The response surface figure about the effect of ultrasonic power and ratio of material to liquid on protein content

图6 提取时间料液比对地木耳蛋白质提取率影响的响应面图Figure 6 The response surface figure about the effect extraction time and ratio of material to liquid on protein content

由图4可知，料液比固定在零水平的条件下，蛋白质的提取率随时间的增大先提高后降低。前期地木耳蛋白质提取率的增加可能是因为超声波一旦与体系组分接触，即刻产生空化效应，地木耳细胞壁得到充分破碎，从而使得蛋白质分子的溶出能力增加。而超声时间和超声功率增加到一定的数值时，蛋白质的某些次级键受到破坏而变性，从而使得蛋白质的溶解度下降。此等高线是椭圆型的，但是并不密集，可说明超声时间和超声功率交互作用显著。

由图5可知，时间固定在零水平的条件下，增加料液比会使蛋白质的提取率先增加后降低，增加超声功率使提取率缓慢增加。等高线逐渐靠近并呈现椭圆，这说明料液比和功率的交互作用显著。由图6可知，功率固定在零水平的条件下，地木耳蛋白质提取率随着料液比和超声时间的增加呈现的是先增加后降低的趋势，并且料液比增加的幅度大于超声时间增加引起的幅度。料液比过大，会使得溶液浓度过小，超声产生的机械作用不能均匀地作用于地木耳细胞，表现为蛋白质提取率的降低。二者等高线是圆形的，可说明超声时间和料液比交互作用并不明显。

2.2.5 最佳提取工艺的确定及模型验证 借助分析软件可直接得出最优提取工艺为：时间27.49min、功率1 000W、料液比1∶41.93（m∶V），最佳提取率为17.85%。但从试验的可行性考虑，将最优工艺调整为：时间27.5min、功率1 000W、料液比1∶42（m∶V）。为了验证响应面法所得结果的准确性，进行3次平行验证实验，所得实际蛋白质平均提取率为17.24%，相对偏差3.41%。由此可说明，响应面法所优化的总蛋白提取条件与实际试验结果相近，参考作用与试验价值较高。

3 结论

本试验采用酶解、冻融及超声法联合处理地木耳材料的方法，并对影响地木耳蛋白质提取率的因素：时间、功率及料液比进行了研究，在此基础上利用Box-Behnken试验设计方案和响应面分析建立了回归方程。由F检验得到因子贡献率为功率＞时间＞料液比。通过Box-Behnken设计响应面法建立三因素三水平的响应面分析试验，得到最优条件为：时间27.5min、功率1 000W和料液比1∶42（m∶V），此工艺下的提取率为17.24%，通过验证实验，证实了该模型的可行性，对地木耳蛋白的进一步开发利用提供了良好的基础。本研究下一步拟在抗氧化活性等方面对本法提取的地木耳蛋白质进行探究，以期为地木耳蛋白质在功能性食品开发等应用中起到推动作用。

1 Kaj Sand-Jensen，Thomas Sand Jespersen.Tolerance of the wide spread cyanobacteriumNostoccommuneto extreme temperature variations（－269to 105℃），pH and salt stress［J］.Physiological Ecology-original Research，2012，169（2）：331～339.

2 Kohji Hori，Genji Ishibashi，TakuoOkita.Hypocholesterolemic effect of blue-green alga，ishikurage（Nostoccommune） in rats fed atherogenic diet［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1994，45（1）：63～70.

3 Kohji Hori，Tomoko Ueno-Mohri，Takuo Okita，et al.Chemical composition，in vitro protein digestibility and in vitro availableiron of blue green alga，Nostoccommune［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1990，40（1）：223～229.

4 岳思君，贾士儒，丁文杰，等.发状念珠藻藻蓝蛋白分离纯化及性质研究［J］.食品与发酵工业，2011，31（9）：1～6.

5 王瑶.地皮菜的人工液体培养及其藻蓝蛋白的分离纯化［D］.西安：西北大学，2012.

6 Donna R Hill，Thomas W Keenan，Richard F Helm，et al.Extracellular polysaccharide ofNostoccommune（Cyanobacteria）inhibits fusion of membrane vesicles during desiccation［J］.Journal of Applied Phycology，1997，9（3）：237～248.

7 Heather E Rasmussen，Kara R Blobaum，Elliot D Jesch，et al.Hypocholesterolemic effect ofNostoccommunevar.sphaeroides Kützing，an edible blue-green alga［J］.European Journal of Nutrition，2009，48（7）：387～394.

8 谢姣.超声波辅助碱法提取红橘种子蛋白质的研究［J］.山东食品发酵，2012（2）：17～20.

9 刘晓庚，高梅，陈梅梅，等.多酶法提取高温菜籽粕中蛋白质的工艺及其优化［J］.中国粮油学报，2012，27（8）：69～72.

10 袁保红，杜青平.地木耳蛋白质提取工艺及其稳定性的研究［J］.食品研究与开发，2007，28（4）：117～120.

11 阎春兰，邓中洋，胡征宇.人工培养地木耳的群体显微结构及营养成分分析［J］.食品科学，2010，31（3）：22～25.

12 章军，徐虹，蔡晖，等.丝状蓝藻Calothrix sp.PCC7601原生质球的分离和再生［J］.厦门大学学报：自然科学版，2000，39（3）：381～385.

13 崔素萍，张洪微，左豫虎，等.冻融和超声波处理提高大米蛋白质提取率初报［J］.食品科学，2008，24（2）：98～100.

14 郭卫芸，杜冰，袁根良，等.反复冻融法破壁啤酒废酵母的研究［J］.酿酒科技，2009（3）：103～105.

15 张雅利，梁花香，曹娜.提取方法对柿多糖提取率及生物活性的影响［J］.食品与生物技术学报，2008，27（6）：18～22.

16 曾婷婷，明生艳.超声波法提取河蚬糖蛋白［J］.江西农业大学学报，2008，30（1）：144～148.

17 周泉城，申德超，区颖刚.超声波辅助提取经膨化大豆粕中低聚糖工艺［J］.农业工程学报，2008，24（5）：245～248.

18 魏文志，付立霞，陈国宏.基于冻融辅助超声波法的小球藻多糖提取工艺优化［J］.农业工程学报，2012，28（16）：270～274.

19 马秀婷，肖志刚，孙旭，等.超声波辅助提取豆渣蛋白工艺优化［J］.食品与机械，2013，29（1）：108～112.

20 贯云娜，吴昊，杨绍兰，等.超声复合酶法提取大蒜多糖的工艺优化［J］.食品与机械，2014，30（1）：199～204.

21 赖红芳，黄秀香，陆俊宇.超声波辅助提取山豆根中的黄酮和多糖工艺优化［J］.食品与机械，2014，30（1）：196～223.

22 柳荫，吴凤智，陈龙，等.考马斯亮蓝法测定核桃水溶性蛋白含量的研究［J］.中国酿造，2013，32（12）：131～133.

23 赵源，刘爱国，吴子健，等.谷朊粉中麦谷蛋白的碱法提取工艺优化［J］.食品与机械，2014，30（1）：220～223.

24 霍丹群，王洪彬，宋兴兴，等.响应面法优化猕猴桃原酒发酵工艺［J］.食品工业科技，2013，34（9）：219～223.

25 樊志勇，孙亮，朱瑞倩，等.响应面法优化液态复合酶制备香蕉汁工艺条件研究［J］.食品工业科技，2013，34（20）：203～207.