DNA指纹技术在生物鉴种中的应用

张奥博

(北京市大峪中学 北京 102300)

1 DNA指纹技术综述

1984年英国莱斯特大学遗传学家Jefferys及其合作者首次通过DNA分子生物学实验方法获得一系列可以在胶片上看到的图纹。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹,很像商品上的条形码。DNA指纹图谱,开创了检测DNA多态性的多种多样的手段,如限制性内切酶酶切片段长度多态性[1]分析、串联重复序列分析等。[2]各种分析方法均以DNA的多态性为基础,产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱,由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性,且仍按简单的孟德尔方式遗传,成为目前最具吸引力的遗传标记。

本文通过对该技术的研究,将其应用在珍稀物种保护和打击珍稀物种走私领域,有很强的应用性。

2 研究实例

(1)研究对象。利用DNA指纹印迹技术,对疑似黄唇鱼的基因样本进行鉴定。(2)研究目的。利用生物学手段,使用DNA指纹印迹技术,鉴别样本所属物种。(3)研究意义。DNA指纹印迹技术在刑事案件、法医学上被广泛的应用,其不仅有助于人种、性别鉴定,而且还可用于器官移植的配型试验等范畴。(4)研究方法:①限制性核酸内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)每一限制性核酸内切酶在切割DNA分子时都有固定的切点序列,DNA分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该切点丢失或增加,用同一限制性内切酶酶切后,所得DNA片段的长度分布也是千变万化的。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),RFLP常用于生物群体的遗传分析。②限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)是一类从原核生物中提取出的酶。它能够特异性地识别双链DNA分子中的某种长度为4-8bp的特定核苷酸序列,并由此处将DNA双链切开。③琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,不带电荷,是很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正极移动,不同DNA分子片段由于分子量和分子构型不同,在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可显示出不同的荧光带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。(5)实验方法。实验利用相关技术,使用黄唇鱼样本,实现生物鉴种的相关应用。首先,将提取好的DNA样本用限制性内切酶酶切成不同大小的DNA片段,按照下列步骤进行:①制取琼脂糖凝胶。进行实验准备,安装电泳槽。将有电泳凝胶床洗净,晾干,用胶带将两端的开口封好,放在水平的工作台上,插上样品梳。然后,称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,并加入EB,置沸水浴中加热至完全溶化(不可加热至沸腾),取出摇匀。最后,将冷却到60℃的琼脂糖溶液倒入电泳槽水平板上。待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,拔出梳子。②电泳。首先,将A、B、C样本DNA分别标号为A、B、C,黄唇鱼DNA标准样本标号为S,DNA Maker标号为M。然后,分别将DNA样品、DNA标准样本、LD5000DNA Maker与上样缓冲液(loading buffer)混匀后,用微量移液器依次将混合液加到样品槽中,每槽加5μl。将点样完成的凝胶放入恒定电场中电泳约30分钟。安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至3-5V/cm,电泳30min后,停止电泳。最后,取出凝胶,放入凝胶成像系统观察,有荧光条带的位置,即为DNA条带,照相记录电泳图谱。

3 结论及改进方法研究

A样本与黄唇鱼样本(S)的DNA图像基本吻合,所以A样本为黄唇鱼

通过实验,我们要研究能否在鉴别鱼是否为黄唇鱼的同时,鉴定鱼的种类及其在进化树上所处的生态位置。在此基础上,还可以用PCR分析方法测出B、C样品DNA片断序列,并判断鱼的种类及其在进化树上所处的生态位置。

研究通过:提取DNA样本—设计保守序列通用引物—PCR扩增—电泳—切取含某一长度DNA片断的凝胶块回收DNA—将回收的DNA片断交由专业机构进行测序—将基因序列放入NCBI网站中进行BLAST比对的步骤。经过BLAST比对,就可以得出B、C样本鱼的种类和其在进化树上所处的的生态位置。

4 结语

RFLP分析实验耗时短,但实验结果精确度较低,只能定性观察,无法判别B、C两种鱼种类;PCR分析实验耗时长,但实验精确度较高,可以定量比对,借助网上数据库可判定样本种类及进化程度。因此,DNA指纹技术在生物鉴种中的应用可以有效地确定其生态位置,在很多相关领域都有重要意义。

[1]Thiermann,A.B.etal.Am.J.Vet.Res.限制性核酸片段多态性分析[A]1986,47:61-66.

[2]刘德立.DNA指纹图谱法及其应用[J]生物化学与生物物理进展,1990,27:6.