龙眼果肉发酵红茶菌饮料*

宋清鹏，胡卓炎，赵雷，周沫霖，余小林

(华南农业大学食品学院，广东广州，510642)

红茶菌，俗称“海宝”，在我国具有悠久的历史，是由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等几种微生物组成的共生体。以茶糖水为培养液，利用红茶菌发酵的饮料是一种很好的保健饮品。红茶菌饮料具有帮助消化、清理肠胃、保肝［1］等保健作用。国内外研究表明:红茶菌饮料也具有解毒、抗癌和增强人体免疫力的功效［2-4］。红茶菌饮料作为健康、安全的饮品，越来越受到人们的欢迎。红茶菌饮料所含有的D-葡糖糖二酸1，4-内酯(D-glucose acid 2-1，4-lactone，DSL)和D-葡萄糖二酸已被广泛地研究。作为抗癌因子，DSL能抑制与癌症相关的β-葡糖醛酸糖苷酶［5］。而在一定条件下DSL能与D-葡萄糖二酸进行转化［6］。因此，研究这两种功能性物质具有一定的意义。

龙眼香甜美味，润滑可口，是我国南方很受欢迎的水果。龙眼果肉有很高的营养价值，具有壮阳益气、补益心脾、润肤美容等多种功效［7-8］。龙眼含糖量约为14%-18%之间［9］，可为红茶菌的生长提供部分碳源和氮源。红茶菌结合龙眼果肉发酵可以赋予饮料新的风味，增加其营养成分。龙眼干含糖量高达30%［10］。从口感方面考虑，高糖龙眼干具有粘度大、多食则腻等缺点;从健康方面看，高糖食品易导致肥胖、高血脂，诱发心脏病、糖尿病等疾病。而经发酵后的龙眼果肉可以进一步加工成具有独特风味、有益健康的低糖龙眼干。这有助于充分利用原料，降低生产成本，提高经济效益。研究不同温度、初始糖度、接种量等因素对龙眼红茶菌饮料发酵的影响，进行工艺条件优化，对进一步的研究具有现实指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

LC-10AT高效液相色谱，日本岛津公司;冷冻离心机，德国ZENTRIFUGEN公司;SB-Aq色谱柱，美国安捷伦公司;UV-2550PC型岛津紫外可见扫描仪分光光度计，日本岛津公司;SKP-01电热恒温箱，湖北省黄石市医疗器械厂;HWS24电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司;BS110S分析天平，德国Sartorius公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

100 mL 0.7%［11］的绿茶水+50 g龙眼果肉→接种→调糖度→8层纱布封口→恒温箱培养→定期测量指标

1.3.2 指标测定

总酸:NaOH 滴定法［12］。

DSL和D-葡萄糖二酸:将发酵液以3500 r/min的速度离心15 min。取上清液，用流动相稀释10倍，经22 μm水系滤膜过滤后进样分析，高效液相色谱分析条件参照张红等(2012)的方法［13］，色谱图见图1。

东安三村太小，有时玩不爽快，父亲就带我和堂妹去复兴公园。最刺激的是高处君临的激流勇进，只见堂妹手里捏紧门票，心情紧张地奔到栏杆口，等到栏杆的铁链松开，她扑通一声跳进船里，两手横握扶柄。父亲站在栏杆外吩咐“要当心”时，工作人员已按住开关，我们跳上船，往矮凳上一坐，即起航了。我们握着两只扶柄，按顺序坐好，一颠一簸，有露牙说笑的，有张嘴开口的，溪水合着节节敲打的拍子，在左右都是绿树丛林的画面里一颠一簸地流向远处去了。堂妹走出来，乐个不停：“这游戏不够惊险，我们玩过山车去，翻的转的都有，年轻人玩得很多，我以前尝试过。”那时，我并不知道公园里有这么稀奇的游戏，那可都是我往常不敢玩的。

1.3.3 单因素试验设计

图1 标准品(a)和样品(b)的DSL(1)和D-葡萄糖二酸(2)色谱图Fig.1 Chromatogram of DSL(1)and D-glucaric acid(2)of standards(a)and samples(b)

考察发酵温度、初始可溶性固形物(TSS:total soluble solid)和接种量3个因素条件对发酵液总酸含量的影响。单因素试验设计表见表1。由于总酸与功能物质D-葡糖糖二酸1，4-内酯和D-葡萄糖二酸极显著相关［14］。因此，可以通过总酸快速判断功能性物质的含量。图5中的预测曲线也验证了功能性物质的最优条件也在单因素实验设计的范围之内。因此单因素试验探讨发酵条件对发酵液总酸含量的影响。

表1 单因素试验设计Table 1 Design of single factor

1.3.4 响应面实验设计

采用3因素3水平的Box-Behnken实验设计，以温度(X1)、TSS(X2)和接种量(X3)3个因素为变量，以发酵液总酸(Y1)、DSL(Y2)和D-葡萄糖二酸(Y3)为响应值，采用期望函数途径优化发酵工艺参数，得出龙眼果肉发酵红茶菌饮料的优化条件，并进行验证实验。表2为实验因素和水平。

表2 Box-Behnken实验因素和水平Table 2 factor and level of Box-Behnken experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同的发酵条件对发酵液总酸度的影响

温度是影响微生物生长和发酵的最重要因素之一。在一定的范围内，微生物的生长代谢随着温度的升高而增加。但是当到达一定温度时，就会开始不利于微生物的代谢生长。继续升高温度，细胞可能不适于生长甚至死亡。将样品分别放置于25、30、35、40℃的恒温条件下进行发酵，定期测量酸度，结果见图2。

图2 温度对发酵液总酸的影响Fig.2 Effect of temperature on total acid of fermentation broth

由图2可以看出，发酵液总酸含量随着发酵时间的延长不断增大，且在第6天酸度达到最大值，而后趋于稳定。30℃下产酸最多(28.01 g/L)，其次是35℃、25℃和40℃。温度较低时，随着温度的升高，微生物细胞内的酶活性提高，反应加快;当温度过高时，细胞内酶失活，不利于微生物生长，从而产酸较少。

2.1.2 初始可溶性固形物含量(TSS)对总酸的影响初始可溶性固形物(TSS)对于红茶菌的影响是两方面的。一方面，红茶菌的生长需要足够的碳源和氮源等，而糖就是其中之一;另一方面，TSS浓度过大，即培养液的渗透压过大，微生物细胞脱水引起质壁分离，不利于红茶菌生长与发酵［15］。因此，红茶菌发酵需要合适的TSS，过高或者过低都不利于发酵。由图3可以看出，初始TSS为14°Brix时，酸产量最高(35.87 g/L)，其次为 10、18°和 6°Brix，且在第 6 天，总酸就达到最大值，而后趋于不变。

图3 初始可溶性固形物含量(TSS)对发酵液总酸的影响Fig.3 Effect of initial total soluble solid(TSS)on total acid of fermentation broth

2.1.3 接种量对总酸的影响

接种量对红茶菌发酵有重要影响。生产上经常通过调整接种量来提高生产效率和经济效益。大量接种红茶菌有利于缩短发酵周期，提高产量。但是，接种量过大，发酵液中的营养物质被主要用于醋酸菌的增殖，并且有大量的代谢物质产生，导致细胞过早发生老化、自溶等现象［16-17］。因此，只有合适的接种量才能保证酸产量和经济效益。由图4可知，在第6天总酸达到最大值。随着接种量的增加，总酸越大。但当接种量增加到18%时，酸产量减少。在接种量为14%时，酸产量最高(30.35 g/L)。

图4 接种量对发酵液总酸的影响Fig.4 Effect of inoculation quantity on total acid of fermentation broth

2.2 期望函数途径优化发酵工艺参数

总酸的产量对于实际生产极其重要。而作为红茶菌中的功能性物质，DSL和D-葡萄糖二酸也是需要考量的重要指标。因此，在利用Box-Behnken实验设计进行工艺优化时，将总酸(Y1)、DSL(Y2)和D-葡萄糖二酸(Y3)作为响应值。按照表2进行实验，得出结果(表3)。

表3 Box-Behnken实验设计与结果Table 3 Design and results of response surface analysis

图5是通过SAS V8软件作响应面处理得来的单因素预测曲线。在实验设计的范围内，随着各个因素水平的增大，Y1(总酸)先增大后减小。这与本研究的单因素实验结果一致(图2-4)。而Y2(DSL)和Y3(D-葡萄糖二酸)的变化趋势与总酸一致，这也说明了Y2和Y3两种功能性物质的最佳发酵条件在本实验设计范围之内。

图5 响应值对不同单因素的预测曲线Fig.5 Prediction profile of responses to different factors

2.2.1 总酸

通过SAS V8软件进行二次回归拟合，得出了Y1(总酸)的二次回归方程为:

表4中对Y1(总酸)的方差分析结果表明，该模型的Prob＞F值＜0.01。这说明该模型是极显著的。而失拟项(＞0.05)不显著。与此同时，该模型的相关系数为99.25%，远远大于90%。这说明模型的相关度很好，可以很好地预测结果。模型中P(X1)和P(X3)均小于0.05，而P(X2)大于0.05，这说明X1(温度)和X3(接种量)对Y1(总酸)显著，而X2(TSS)则对总酸不显著。X1和X3之间的交互作用较显著，其他交互作用不显著。F值能在相同自由度的情况下代表某个因素对于响应值的重要性。从表5可以看出，F(X1)＞F(X3)＞F(X2)。因此，各因素对度龙眼果肉发酵红茶菌饮料的总酸影响程度大小顺序为:X1(温度)＞X3(接种量)＞X2(TSS)。

2.2.2 D-葡糖糖二酸 1，4-内酯(DSL)

同理分析得到Y2(DSL)的二次回归方程:

该模型的Prob＞F值＜0.01，所以该模型是极显著的;失拟项不显著;而决定系数R2=99.02%，这说明该模型的相关度很好，能够很好地反应真实数据。X1、X2和X2的P值均小于0.05。因此，各因素对Y2(DSL)均显著。X1、X3之间的交互作用显著(图6(a))，而其他单因素之间的交互作用不显著。随着X1(温度)和X3(接种量)同时增大，Y2(DSL)的含量逐渐增加到最大值，而后又慢慢变小。分析F值，可以得到，各因素对DSL合成量的影响大小顺序为 X2(TSS)，X3(接种量)，X1(温度)。这是因为 DSL是由D-葡萄糖二酸转化而来。而D-葡萄糖二酸来源于醋酸菌分解蔗糖后得到的葡萄糖［18］。因此，蔗糖的量(TSS)对DSL的合成量影响最大。

表4 各响应值的方差析表Table 4 ANOVA for different responses

2.2.3 D-葡萄糖二酸

分析得到Y3的二次回归方程如下:

该模型极显著，失拟项不显著，说明模型拟合较好。决定系数R2=99.25%，即该模型相关度极好。同上分析表4，单因素X1(温度)、X2(TSS)和X3(接种量)对Y3(D-葡萄糖二酸)均为显著。与Y2模型中结果一致，3因素之间中只有X1、X3的交互作用显著(图6)。当X1(温度)X3(接种量)均增大时，Y3(D-葡萄糖二酸)增大到最大值再逐渐变小。同时这也在某种程度上验证了DSL和D-葡萄糖二酸之间有一定的关系。而事实研究也表明两种功能性物质之间可以进行转化［6］。各单因素 F值说明X2(TSS)对 Y3(D-葡萄糖二酸)的影响最大，其次是X3(接种量)和X1(温度)。

2.2.4 最佳条件的筛选

图6 温度和接种量对DSL和D-葡萄糖二酸影响Fig.6 Effect of temperature andinoculation quantity on DSL and D-glucaric acid

利用SAS软件进一步对数据分析计算，将Y2(DSL)作为优先考虑的响应值，得出一系列总酸的较优发酵条件。在这些条件中筛选出比较适合响应值Y1(总酸)和Y3(D-葡萄糖二酸)的较优的水平条件:X1(温度)为 -0.07，X2(TSS)为 0.09，X3(接种量)为0.15。转换后的实际条件X1(温度)为29.6℃，X2(TSS)为14.7°Brix，X3(接种量)为14.1%。依此条件进行实验，测得发酵液的总酸为26.87 g/L，DSL为4.51 g/L，D-葡萄糖二酸为18.01 g/L(表5)。T检验结果表明，各项指标的实验值与预测值无显著性差异。这进一步说明模型能够准确地预测结果。

表5 优化条件下的实验结果Table 5 results under optimal condition of fermentation

3 结论与展望

(1)利用龙眼果肉结合红茶菌进行发酵的最佳条件为:温度29.6℃，初始可溶性固形物为14.7°Brix，接种量为14.1%，发酵时间6d。依此条件进行发酵，所得发酵液总酸含量为26.87 g/L，DSL为4.51 g/L，D-葡萄糖二酸为 18.01 g/L。

(2)红茶菌的发酵赋予了龙眼果肉特殊的风味和功能性成分。经发酵后的龙眼果肉可以进一步加工成有益健康的低糖龙眼干。这样可以高效利用原料，节约成本，提高经济效益，具有现实的生产意义。

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