植物源α-低聚半乳糖制备工艺条件优化*

侯晓慧，张金泽，林静，段素芳，高加涛，周志桥

(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)

低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)被认为是和母乳低聚糖结构最相近的低聚糖，已批准应用于婴幼儿配方食品之中［1］。低聚半乳糖根据其糖苷键结构的不同，可分为 α-型和 β-型的低聚半乳糖［2］，目前工业生产的低聚半乳糖，以乳糖为原料，通过半乳糖苷酶的作用，得到β-型的低聚半乳糖［3-4］，其过程是乳糖水解产生的半乳糖基，连接到另一个乳糖的半乳糖基上，形成葡萄糖-半乳糖-半乳糖的所谓半乳三糖。半乳糖基再连接到半乳三糖上，形成半乳四糖，结构为:葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖，并可进一步形成半乳五糖、半乳六糖等等，也可生成半乳糖-半乳糖，半乳糖-半乳糖-半乳糖等低聚糖混合物。

泽兰中含有棉子糖(果糖-葡萄糖-半乳糖)、水苏糖(果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖)、毛蕊五糖(果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)等 α-型的低聚糖［5］。使用微生物发酵的方法，可以定向把泽兰低聚糖中的果糖剪切下来并加以利用，得到新型的α-型低聚半乳糖，其糖基的组成和用乳糖为原料生产的低聚糖一致，包括蜜二糖(葡萄糖-半乳糖)、半乳三糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖)、半乳四糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)、半乳五糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)等。本实验在已筛选出符合实验条件的菌株和进行了前期单因素试验的基础上，采用响应面法对其发酵条件做进一步优化，以期得到更高含量的α-低聚半乳糖产品。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

酵母菌(yeast，编号 SB)，北京君悦诚品科贸有限公司;酵母膏，北京奥博星生物技术有限公司;Mg-SO4(化学纯)，北京五七六零一化工厂;KH2PO4(分析纯)，西陇化工股份有限公司;MRS培养基(CM188)北京陆桥技术有限责任公司;营养肉汤培养基(CM142)，北京陆桥技术有限责任公司。

初始发酵培养基:酵母膏1.5 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL，KH2PO40.1 g/100 mL，溶于泽兰浸提液，pH=(6.5±0.2)。

1.1.2 设备仪器

立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-75G)，上海东亚压力容器制造有限公司;厌氧培养箱(XL-YY)，上海馨朗电子科技有限公司;智能恒温恒湿培养箱(FJX-158S)，宁波海曙赛福实验仪器厂;高效液相色谱仪、示差检测器(LC10-AT)，日本岛津公司;色谱柱(氨基键合柱 Hypersil-NH2，填料粒径 5 μm，柱子尺寸 Φ 4.6 mm×250 mm)，大连依利特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵条件的优化设计

1.2.1.1 Plackett-Burman设计

通过单因素试验发现，影响α-低聚半乳糖含量的主要因素有:发酵温度、菌种接种量、初始糖浓度、酵母膏、MgSO4·7H2O和 KH2PO46个因素。用Plackett-Burman设计对以上6个因素进行全面考察，选用N=12的 P-B设计，G～L为虚拟变量，用来估计实验误差。各因素试验设计水平见表1，实验结果用Design-Expert软件进行数据分析。

表1 Plackett-Burman试验设计水平Table 1 Experimental levels of Plackett-Burman

1.2.1.2 最陡爬坡试验接近最大响应区域

（1）进一步完善制度建设，加强制度落实。在全面贯彻执行国家有关规定及建设单位管理制度的基础上，根据项目特点，针对性地补充完善各项管理制度（如：《航道疏浚施工控制要点》），作为企业内部的执行标准。并通过举办培训班、班前教育等活动，使参建人员熟悉各项相应的管理制度。制定各项责任制（如：《技术、安全交底责任制》），明确岗位职责，加大考评、检查及奖惩力度，使大家知道该干什么、怎么干等。

根据P-B设计结果筛选出影响α-低聚半乳糖含量的显著因素，并以各显著因素的正负效应确定下一步试验的最陡爬坡路径(包括变化方向和变化步长)，快速地逼近最佳区域。试验设计见表2。

表2 最陡爬坡试验设计Table 2 Experimental design of steepest ascent

1.2.1.3 响应面试验设计

通过Plackett-Burman试验确定出影响α-低聚半乳糖含量的主要因素，进而由最陡爬坡试验确定接近响应值区域显著因素的浓度，利用Box-Behnke试验设计进一步优化。其试验设计见表3。每个因素有3个水平，以α-低聚半乳糖含量为响应值，实验数据用Design-Expert软件进行多项式回归分析。

表3 Box-Behnke试验设计Table 3 Experimental levels of Box-Behnke

1.2.2 发酵条件

泽兰经3遍80℃左右热水浸泡榨汁得到浸提液，添加菌种及各种营养成分，放入恒温摇床培养箱中培养一定时间后取样测定。

1.2.3 α-低聚半乳糖含量的测定

发酵结束后，取50 mL糖液，加0.5 g活性炭对糖液进行脱色，加热至80℃搅拌30 min左右，过滤，滤液稀释至折光1.0，经0.22 μm微孔滤膜过滤到样品中，用HPLC分析测定。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计筛选影响α-低聚半乳糖含量的主要因素

试验设计及结果见表4。因素G-K为dummy variables。每组试验有3个重复，以平均值为准。

各因素参数效应分析见表5，由表5可知，对α-低聚半乳糖含量有显著影响(可信度＞90%)的发酵条件因素包括发酵温度、初始糖浓度、酵母膏和KH2PO44个，且均为显著负效应。由此，接下来的试验主要考察这4个因素，且应适当降低各因素水平。

表4 Plackett-Burman试验设计及结果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman试验结果各参数分析Table 5 Parameter analysis and estimates of Plackett-Burman

2.2 最陡爬坡试验接近最大响应面区域

根据Plackett-Burman试验结果，及初始糖浓度、发酵温度、酵母膏和KH2PO44个因素效应大小的比例，设定它们的变化方向和步长，其他因素分别取各自的低水平进行试验，试验设计及结果见表6。由表6可知，随着4个重要因素的不同变化，糖液中α-低聚半乳糖含量的变化趋势是先上升后下降，其中第4组的α-低聚半乳糖含量最高，响应变量接近最大响应区域，所以以第4组条件为中心点进行响应面分析。

表6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 Box-Behnke试验设计重要因素的最优水平

以发酵温度、初始糖浓度、酵母膏和KH2PO44个重要因素为自变量，试验设计及结果见表7。

以α-GOS(Y)含量为响应值，利用Design-Expert软件对表7的结果进行回归拟合，得到二阶回归方程为:Y=94.52+(1.410 17E-015)A-0.575B-(1.281 98E-015)C+0.025D-0.125AB-0.075AC+0AD+0.275BC+0.325BD+0.15CD-3.26A2-2.397 5B2-1.36C2-1.122 5D2。此数学模型的方差分析结果如表8所示，相关系数达到0.98，说明模型对实际情况的拟合较好。因此可用回归方程对最佳发酵条件进行预测。

表7 Box-Behnke试验设计及结果Table 7 Experimental design and results of Box-Behnke

表8 回归模型方程的方差分析Table 8 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of quadratic response

2.4 响应面分析及最佳发酵条件确定

利用Design-Expert软件对回归模型进行响应面分析，得到各响应面立体分析模型及等高线图，见图1～图8。

图1 Y=f(A，B)的响应曲面Fig.1 Response surface of Y=f(A，B)

图2 Y=f(A，C)的响应曲面Fig.2 Response surface of Y=f(A，C)

图3 Y=f(A，D)的响应曲面Fig.3 Response surface of Y=f(A，D)

图4 Y=f(B，C)的响应曲面Fig.4 Response surface of Y=f(B，C)

图5 Y=f(B，D)的响应曲面Fig.5 Response surface of Y=f(B，D)

图6 Y=f(C，D)的响应曲面Fig.6 Response surface of Y=f(C，D)

由图1～图3可以看出，在较低发酵温度时(＜28℃)α-低聚半乳糖含量有随发酵温度增高而增加的趋势，在较高发酵温度时(＞28℃)α-低聚半乳糖含量有随发酵温度增高而减少的趋势;在发酵温度不变的条件下，α-低聚半乳糖含量随初始糖浓度、酵母膏或KH2PO4浓度的增大呈先增加后减少的变化趋势，且在中心点附近的低浓度和高浓度的变化程度相接近。由图4～图5可以看出，在较低初始糖浓度时(＜9°Brix)α-低聚半乳糖含量有随初始糖浓度增大而增加的趋势，在较高初始糖浓度时(＞9°Brix)α-低聚半乳糖含量有随初始糖浓度增大而减少的趋势，且后者的变化程度明显显著于前者;在初始糖浓度不变的条件下，α-低聚半乳糖含量随酵母膏或KH2PO4浓度的增大呈先增加后减少的变化趋势。由图6可以看出，在较低酵母膏浓度时(＜1.2 g/100 mL)，α-低聚半乳糖含量有随酵母膏浓度的增大而增加的趋势，在较高酵母膏浓度时(＞1.2 g/100 mL)，α-低聚半乳糖含量有随酵母膏浓度的增大而减少的趋势，但是变化程度不明显;在酵母膏浓度不变的条件下，α-低聚半乳糖含量随KH2PO4浓度的增大呈先增加后减少的变化趋势，但是变化趋势也不是非常明显。

综合图1～图6分析结果，发酵温度、初始糖浓度、酵母膏和KH2PO4均对发酵液中α-低聚半乳糖含量有显著影响，其中发酵温度和初始糖浓度的作用更加显著。四者之间存在交互影响作用，与方差分析结果一致。

通过响应优化器分析知α-低聚半乳糖含量的最大值出现在A、B、C、D 的编码值分别为(0，-0.12，-0.01，-0.01)时，即发酵温度为28℃、初始糖浓度为8.76°Brix、酵母膏浓度为 1.2 g/100 mL、KH2PO4浓度为0.21 g/100 mL时，此时α-低聚半乳糖含量达到最大值为94.55%。以此条件进行微生物发酵，三次发酵进行试验验证，得到 α-低聚半乳糖含量为94.0%，这与预测值基本吻合。经HPLC分析测定的结果见图7。

图7 α-低聚半乳糖图谱Fig.7 The fingerprint of α-GOS

3 结论

本实验通过Plackett-Burman设计及响应面分析，确定了微生物发酵的最佳条件为发酵温度28℃、初始糖浓度8.76°Brix、酵母膏浓度1.2 g/100 mL、KH2PO4浓度0.21 g/100 mL。综合以上工艺参数对泽兰浸提液进行微生物发酵试验得到的发酵液中α-低聚半乳糖含量为93.7%，比优化前含量提高了近8%。

［1］ 孙建琴，王惠群.母乳低聚糖及益生元与婴幼儿营养和健康［J］.国外医学儿科学分册，2003，30(2):68-70.

［2］ 徐晨，陈历俊，石维忱，等.低聚半乳糖的研究进展及应用［J］.中国食品添加剂，2011(1):205-209.

［3］ 薛雅莺，袁卫涛，杨海军.低聚半乳糖的特性及应用前景［J］.发酵科技通讯，2011，40(3):50-52.

［4］ Duarte P M Torres，Maria do Pilar F Goncalves，Jose A Teixeira， etal. Galacto-oligosaccharides:production，properties，applications， and significance as prebiotics［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2010，9(5):438-454.

［5］ Xingbin Yang，Yan Zhao，Nianwu He，et al.Isolation，characterization，and immunological effects of α—galacto—oligosaccharides from a new source，the herb lycopus iucidus turcz［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(14):8 253-8 258.