自然发酵甜面酱中耐高温生香酵母的鉴定与挥发性香气成分分析*

石娇娇，张建军，邓静，邓毛程，吴华昌

1(四川理工学院，四川自贡，643000) 2(广东轻工业职业技术学院，广东广州，510300)

自然发酵甜面酱是面粉经过高盐拌曲，日晒夜露而成的传统调味品，其口感浓郁，细腻可口，以独特的酯香和酱香味而深受消费者欢迎［1］。在甜面酱风味形成的过程中酵母菌起到了至关重要的作用，其发酵产生的乙醇和细菌发酵产生的有机酸在酯化酶的作用下反应生成酯类，形成风味成分的主体［2］。

生香酵母是一类能够代谢产生香气成分的酵母菌的总称，发酵过程中除参与醛缩醇类、含硫化合物等香气成份的生成外，还一定程度地参与氨基酸和有机酸类的生成，因此能显著增加食品的香气成份［3］。目前研究人员对生香酵母的应用已做了较多尝试，Thin Thin Wah［4］等将 Pichia guilliermondii和 Zygosaccharomyces rouxii共培养添加到泰国豆酱中，发酵2个月的样品中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯含量分别提高了1.8、4.2倍，豆酱特征性香气成分 HEMF 也提高了2.5 倍;Jie feng［5］等发现 Candida etchellsii能够大量产生酒石酸、苹果酸等有机酸，也能够大量合成豆酱中独特的香味成分—愈创木酚(4-EG)。曾鹏［6］利用嗜杀型生香酵母成功将清酒中的总酯含量提高了50%。因此将生香酵母添加到发酵食品中对改善产品风味，提高产品质量，具有重大的实践意义。然而关于甜面酱中生香酵母的研究则比较少，曾灿伟［7］确定了自然面酱中仅存在酿酒酵母且具有较强的产醇能力，重要的酯类物质是由前期霉菌产生的。孟鸳［8］等证明了随着温度的升高，酯类物质逐渐减少，而醛类物质逐渐增多。因此目前对于甜面酱中生香酵母的研究较为笼统，对特定菌株的相关挥发性香气成分也未见报道。

在实际发酵过程中甜面酱酱醅的温度可达到45～50℃［9］，这将严重抑制生香酵母的生长和代谢，所以应用于甜面酱生产中的生香酵母菌必须具有一定的耐高温性。因此筛选耐高温生香酵母并研究其高温下代谢产生的香气成分，对甜面酱的实际工业化生产具有重要的现实意义。

本实验选择已发酵7个月的甜面酱样品筛选耐高温生香酵母，进行了菌种分类鉴定以及高温发酵产物中的挥发性香气成分的初步分析，明确了不同生香酵母菌株的挥发性香气成分和相对含量，为其在甜面酱工业生产中的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品和培养基

甜面酱:四川省自贡市某食品有限公司2012年8月样品(发酵7个月)。

孟加拉红培养基:蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，琼脂 2%，1/3000 孟加拉红溶液10%，补足蒸馏水，分装121℃灭菌20 min。氯霉素0.01%用少量乙醇溶解，加入已灭菌的45～50℃培养基中，制备平板。

YPD培养基:酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，自然pH。

豆芽汁培养基:称取100 g黄豆芽，加水1 000 mL煮沸30 min，用纱布过滤，放入20 g葡萄糖加热溶解后，分装121℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 生香酵母的筛选

1.2.1.1 耐高温酵母菌的筛选

准确称取5 g甜面酱于45 mL无菌水中，置于摇床45℃，150 r/min培养30 min。用移液枪准确吸取1 mL上清液做十倍梯度稀释，取不同浓度的稀释液100 μL涂布到孟加拉红平板培养基上，在恒温培养箱中45℃培养2～3 d，挑取疑似酵母菌株的单菌落镜检、纯化并保藏。

1.2.1.2 生香能力研究

挑取1环斜面耐高温酵母接种至50 mLYPD培养基中，28℃恒温培养20 h，制成种子液。按2%的接种量，接种到豆芽汁液体培养基中，于45℃恒温静置培养5 d，嗅闻法确定是否产香［10］。

1.2.1.3 生香酵母的鉴定

参照《真菌鉴定手册》［11］及《酵母菌的特征与鉴定手册》［12］对耐高温生香酵母进行形态学和生理生化鉴定，相关生理生化实验包括糖发酵、碳源/氮源同化、高糖发酵、脲酶和石蕊牛奶实验。

1.2.2 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法检测生香酵母的挥发性香气成分

1.2.2.1 顶空固相微萃取方法条件

准确量取6 mL发酵液于15 mL顶空瓶中恒温(60 ℃)水浴，将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中平衡5 min后吸附30 min(在固相微萃取装置上实现)，后将萃取头移入气相色谱的高温汽化室中解吸5 min，进行GC-MS分析(搅拌速度600 r/min)，测定生香酵母发酵液中的挥发性香气成分。

1.2.2.2 定性与定量分析

实验数据处理由GC-MS数据分析软件系统完成，未知化合物经计算机检索同时与NSIT谱库和RTLPEST谱库相匹配，仅当匹配度大于800(最大值为1 000)的鉴定结果才予以报道。采用峰面积归一化法定量计算出各挥发性成分的含量。

1.2.2.3 GC-MS 条件

色谱条件:毛细管色谱柱Agilent HP-INNOWax(60 m ×250 μm，0.25 μm);手动无分流进样，进样口温度250℃;程序升温:初始温度45℃，保留3 min，以10℃/min的速率升至200℃，保留5 min;检测器温度250℃;载气He，流速1 mL/min。

质谱条件:EI电离源，电子能量70 eV，扫描范围10～450 u，离子源温度230℃;接口温度250℃。

1.2.3 筛选不同菌株主体香气成分

根据风味贡献率理论，即香气物质的浓度或相对含量与香气阈值的比值确定特征香气的方法，从生香酵母高温发酵产生的挥发性香气成分中筛选出主体香气。

2 试验结果

2.1 耐高温生香酵母的筛选

根据酵母菌具有出芽生殖这一典型特征，按照1.2.1.1的方法从自然发酵甜面酱中筛选出15株在45℃高温下生长良好的的酵母菌株(菌株生长相关数据另行发表)，进一步做产香能力研究，结果如表1所示。耐高温菌株Y1、Y4、Y5、Y7、Y9和 Y11在豆芽汁培养基中45℃高温发酵5 d后能够产生浓郁的香气，Y2、Y8、Y10、Y12、Y14 和 Y15 产生的香气较浓，Y6和Y13产生较淡的香气，而Y3发酵产生的香气最弱。

表1 耐高温菌株产香能力研究Table 1 The aroma-producing capacity study of yeast strains resistant to high temperature

2.2 生香酵母的鉴定

2.2.1 菌落形态及个体形态

划线培养已纯化的耐高温生香酵母，于28℃恒温培养24 h，肉眼观察酵母菌株的菌落形态，显微镜下观察酵母的细胞形态及生成孢子的情况，结果如表2所示。

表2 生香酵母的菌落及个体形态Table 2 The colonies and individual shapes of aroma-producing yeast strains

2.2.2 生理生化鉴定

对照《真菌鉴定手册》及《酵母菌的特征与鉴定手册》对6株耐高温生香酵母进行生理生化鉴定试验，鉴定结果如表3所示。

表3 生香酵母的生理生化鉴定Table 3 The physiological and biochemical identification of aroma-producing yeast strains

依据《真菌鉴定手册》及《酵母菌的特征与鉴定手册》和各分离菌株的形态特征、生理生化特征，初步将分离菌种Y1、Y4、Y5归类为汉逊酵母(Hansenula)，Y7、Y9 为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Y11为红酵母(Rhodotorula)。

2.3 高温发酵代谢产物中挥发性成分的分析

在豆芽汁培养基中高温发酵筛选出来的6株耐高温生香酵母，利用顶空固相微萃取-气质联用技术检测发酵液中的挥发性香气成分，结果如表4所示。

由表4可知，不同生香酵母高温发酵产生的挥发性香气成分的种类和含量存在极大差异。产生挥发性香气成分种类和相对含量最大的均为Y7，共检测出7种化合物，香气成分占总挥发性成分总量的94.05%，其中乙醇的相对含量最高，但阈值也最高(14 000 mg/L)，因此香气值远远小于其他香气成分;辛酸乙酯(阈值1 mg/L)和己酸乙酯(阈值1.3 mg/L)的含量相对较高，且阈值较低，因此香气值相对较大;醛类物质的阈值相对较高且含量较小，因此菌株Y7高温发酵的主体香气成分是辛酸乙酯，其次为己酸乙酯。香气成分占总挥发性成分比例稍稍低于Y7菌株的是Y1(89.08%)，其中己酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯(阈值1.5 mg/L)和辛酸乙酯的相对含量占据绝对优势，香气值最大;癸酸乙酯的阈值虽然也较低(1.5 mg/L)，但其相对含量仅为0.14%，香气值最低;2-戊基呋喃属于杂环类物质，阈值一般高于酯类物质且相对含量较低，香气值也较低，因此菌株Y1最主要的香气成分是己酸乙酯，其次为乙酸-3-甲基丁酯。菌株Y5和Y11高温发酵产生的香气成分所占比例相当，其中Y5产生的辛酸乙酯和3-羟基丁酮所占比例相对较大，但比较相对含量和阈值可知，菌株Y5和Y11最主要的香气成分均为辛酸乙酯。菌株Y9高温发酵除了产生香气值最大的辛酸乙酯外，还能够产生苯乙醇、苯甲醛和癸酸乙酯，但三者的阈值较高，且含量远远低于辛酸乙酯，因此菌株Y9的最主要的香气成分也是辛酸乙酯。Y4高温发酵只检测得到2种香气成分，占总挥发性成分的24.31%，其中己酸乙酯是最主要的香气成分。

随着发酵过程的进行，不同菌株发酵终产物组成趋于稳定，酯类物质成为主要的香气成分，为甜面酱增酯添香。不同菌株能够特异性产生相关香气成分，其中乙酸-3-甲基丁酯仅在Y1发酵过程中产生。2-甲基丙醇和庚烯仅在Y5发酵过程中产生，前者为传统发酵食品中重要的芳香杂醇，常通过类似鲁氏接合酵母中的Ehrlich途径产生，后者是一种极不稳定的果香烯烃类，可通过氧化或还原形成较为稳定的大分子香气化合物。壬醛仅在菌株Y7发酵过程中产生，是一种重要的食品添加剂和常用香料，性质也较为稳定。在自然发酵甜面酱中，不同生香酵母的代谢途径相互交错，产生更为复杂的代谢产物，对甜面酱的风味形成至关重要。

表4 耐高温生香酵母发酵代谢产物中挥发性香气成分的检测Table 4 Detection of metabolism of aroma-producing yeast strains resistant to high temperature

3 讨论

本实验从自然发酵甜面酱中筛选得到了6株能够耐受45℃且正常生长的生香酵母，通过形态学和相关生理生化鉴定，初步鉴定3株为汉逊酵母，2株为酿酒酵母，1株为胶红酵母。利用顶空固相微萃取-气质联用技术检测了生香酵母高温发酵代谢产物的差异，确定了不同菌株高温下的主体香气情况，其中Y1和Y4最主要的香气成分为己酸乙酯，而其余菌株最主要的香气成分均为辛酸乙酯，从而为菌株在甜面酱中的工业化应用奠定基础。然而除了已知的生香作用外，生香酵母在不同发酵食品中还有很多其他的功能。

汉逊酵母除了能够促进豆酱特征香气成分(如4-愈创木酚、乙酸乙酯、HEMF)的形成，其自身也能够合成异丙醇、异戊醇等高级醇，糠醛、苯甲醛等醛类，从而影响豆酱中的香气平衡，目前在韩国大酱［13］、酱醪［14］、中国黄豆酱［15］中都已分离得到。汉逊酵母常和乳酸菌共培养作为发酵剂在干酪［16］、香肠［17］等发酵过程中已有应用，可以显著提高发酵食品的风味，同时缩短生产周期。在酒类酿造和工业酒精生产中，酿酒酵母发挥了举足轻重的作用。近年来对酿酒酵母生产油脂、为酱类食品增酯增香能力的研究也大大提高了其应用价值。高玉荣［18］等在豆酱快速酿造工艺后发酵期添加酿酒酵母，缩短了后发酵时间并促进乙醇等风味物质的形成，使成品在较短的时间内形成酱品所特有的醇香及酯香。红酵母能产生丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等多种氨基酸［19］，这些氨基酸构成发酵食品的主要鲜味成分;能发酵产胡萝卜素［20］，使发酵食品具有安全诱人的色泽。但有关红酵母应用到食品中产香的研究还未见报道。本实验中红酵母高温发酵产生辛酸乙酯等阈值极低的挥发性香气成分，己酸乙酯、3-羟基-2-丁酮和2-戊基呋喃等常见的香气成分，在甜面酱高温酱醅发酵中具有极大的应用前景。

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