酶标仪法测定γ-氨基丁酸

梁慧，薛正莲，周扬，汪冬冬，叶杨

(安徽工程大学生物与化学工程学院，微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖，241000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质天然氨基酸，又称哌啶酸、氨酪酸，化学名4-氨基丁酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，在动物、植物和微生物中广泛存在［1-2］。由谷氨酸(glutamic acid，Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，简称GAD或GDC)催化而来，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质［3-5］。关于GABA的测定近年来国内外有酶法、色质联用法、柱层析荧光测定法、纸电泳比色、毛细管气相色谱法、放射性受体法、毛细管电泳法、液相色谱法等，但以上方法大多成本高、费时长，不宜用于大批量样品的定量分析。

可见光分光光度计是常用的化合物分析测量仪器［6］，酶标仪是酶联免疫测定的常用仪器［7］，测定物质含量二者均服从朗伯-比尔定律:物质在一定波长处的吸光度与浓度之间存在线性关系，从而实现对化合物定量检测的目的。可见光分光光度计法影响因素少，但操作繁琐，试剂用量大，消耗时间长;酶标仪影响因素较多，但速度快，效率高，试剂用量少，适于大批量样品的快速分析［8］。

鉴于在菌种选育过程中，获得的GABA乳酸菌突变株的数量多，通过96孔板发酵的样品多，寻找与之相匹配的简便、准确、快速的GABA测定方法尤为重要。本实验采用酶标仪法测定GABA含量，并与分光光度计法进行了比较，用Origin软件对2种方法进行拟合分析，显示2种测定方法具有很好的一致性。到目前为止，尚未见有关酶标仪测定GABA含量方面的相关研究报道，本实验研究结果对于快速，简便、准确的测定GABA具有很好的指导意义，为高通量选育GABA乳酸菌奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

γ-氨基丁酸(分析纯)，上海元吉化工有限公司;L-Glu(纯度99.9%，食品级)，河南莲花味精股份有限公司;NaClO(生化试剂)，国药集团化学试剂有限公司;H3BO3(分析纯)，国药集团化学试剂总厂;硼砂(分析纯)，国药集团化学试剂总厂;6%重蒸苯酚(生化试剂)，国药集团化学试剂有限公司;FC型酶标仪，Thermo Fisher Scientific;常温室压等离子体(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司;单道、八道手动可调移液器，Sartorius;723N可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司;Sorvall ST 16R Centrifug，Thermo Fisher Scientific。

1.2 菌种

粪肠乳酸球菌:本实验室筛选获得。

1.3 培养基

种子培养基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物10、葡萄糖5、乙酸钠 5、K2HPO40.2、柠檬酸三胺 0.2、MgSO40.2、MnSO40.05、吐温 -80 0.1 mL/L，pH 6.5。115℃，灭菌25 min。

发酵培养基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨5、葡萄糖10、丁二酸钠5、加入1%的 L-Glu，pH 6.5。115℃，灭菌25 min。

1.4 实验方法

1.4.1 GABA测定原理及方法

比色法测定GABA的原理:Berthelot反应是利用苯酚和NaClO与游离氨反应，生成蓝色的吲哚酚类(Indophenol dye)，GABA在该反应中反应灵敏，而α-氨基酸响应低，利用在反应中的差别来达到测定混合氨基酸中GABA的目的［9-10］。

测定方法:参照文献［10-11］进行。吸取样液0.8 mL，依次加入1 mol/L的 Na2CO3溶液0.2 mL，0.2 mol/L pH10.0的硼酸盐缓冲液1 mL，6%的重蒸苯酚2 mL，混匀后加入NaClO溶液2 mL，混匀后放置4～8 min，然后沸水浴10 min，立即冰浴20 min，待溶液出现蓝绿色后，加入4 mL 60%的乙醇溶液，混匀后放置20 min，酶标仪在640 nm测定OD值。

1.4.2 测定方法中主要影响因素的优化

取0.4、0.6和0.8 mol/L的标准GABA溶液0.8 mL，按1.4.1的测定方法对主要影响因素硼酸盐缓冲液、重蒸苯酚以及NaClO的添加量进行优化;其中对硼酸盐缓冲液添加量进行优化时0.2 mol/L pH 10.0的硼酸盐缓冲液取值分别为0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL;对6%的重蒸苯酚进行优化时6%的重蒸苯酚取值分别为 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL;对NaClO进行优化时含有效氯5.2%的NaClO溶液取值分别为 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL。

1.4.3 标准曲线的建立

采用底物L-Glu与产物GABA混合配制标样。精确配制1 g/L GABA和1 g/L L-Glu各100 mL按表1混合制成标准液。按优化后的方法在640 nm下酶标仪测值绘制标准曲线，同时用可见光分光光度计在640 nm下进行测定并绘制标准曲线。

表1 标准溶液GABA和L-Glu组成表Table 1 Ingredients of the standard mixed solution composed by GABA and glutamic acid

1.4.4 精密度试验

分别以浓度0.25 g/L和0.75 g/L的GABA按工作曲线的建立方法进行同样操作，按标准曲线的线性回归方程计算GABA的含量，并进行统计分析。

1.4.5 加标回收率试验

分别取配制好的 1 g/L L-Glu 9.972、9.944、9.72、7.5、2.5 mL，添加配 制好的 1 g/L GABA 0.028、0.056、0.28、2.5、7.5 mL，配制成 0.002 8、0.005 6、0.028、0.25、0.75 g/L 的 GABA 按优化后的方法测值，并且按标准曲线的线性回归方程计算GABA的含量，进行统计分析。

1.4.6 两种方法的拟合验证

将实验中通过ARTP诱变所获得的75株乳酸菌突变菌经96孔板发酵制得的发酵液离心，取上清液0.8 mL，按优化后的方法，在640 nm下分别采用酶标仪与可见光分光光度计进行测值，并用origin 8.0 professional软件拟合验证。

2 结果与讨论

2.1 硼酸盐缓冲液添加量的影响

按方法1.4.2所测得的结果见图1。

图1 硼酸盐缓冲液添加量对吸光度的影响Fig.1 The influence of borate buffer on absorbance

如图1所示，随着硼酸盐缓冲液的添加量的增加OD值出现先上升后下降的趋势，且0.4、0.6与0.8 mol/L的GABA都在添加0.75 mL的0.2 mol/L pH10.0的硼酸盐缓冲液时OD值达到最大，这是由于添加0.75 mL的0.2 mol/L pH 10.0的硼酸盐缓冲液所达到的pH值是Berthelot反应的最适pH值，添加量过多过少都不利于反应的进行，不能使反应达到最大效率，因此本实验确定添加0.2 mol/L pH10.0的硼酸盐缓冲液0.75 mL。

2.2 6%重蒸苯酚添加量的影响

按方法1.4.2所测得的结果见图2。

图2 6%重蒸苯酚添加量对吸光度的影响Fig.2 The influence of 6%redistilled phenol on absorbance

如图2所示随着6%重蒸苯酚添加量的增加，OD值呈先增加后减少的趋势，且0.4、0.6与0.8 mol/L的GABA都在添加2.5 mL 6%重蒸苯酚时达到最高OD值，究其原因为在Berthelot反应中苯酚添加量与NaClO中有效氯含量存在一定比例关系［12］;因此，本实验确定6%重蒸苯酚的添加量为2.5 mL。

2.3 NaClO添加量的影响

按方法1.4.2所测得的结果见图3。

图3 NaClO的添加量对吸光度的影响Fig.3 The influence of NaClO on absorbance

如图3所示随着NaClO添加量的增加，OD值呈先增加后减少的趋势，且0.4、0.6与0.8 mol/L的GABA都在添加2 mL含有效氯5.2%的NaClO时达到最高OD值，其原因为在Berthelot反应中2 mL 6%的重蒸苯酚与含有效氯5.2%的NaClO在一定pH条件下与游离氨反应，反应效率最高。

2.4 标准曲线的建立

按方法1.4.3分别绘制通过可见光分光光度计与酶标仪测得的GABA浓度的标准曲线，结果分别见图4和图5。

图4 可见光分光光度计的标准曲线Fig.4 The standard curve of GABA by spectrophotometer

图5 酶标仪的标准曲线Fig.5 The standard curve of GABA by microplate reader

由图5可知，GABA的浓度在0～1.0 g/L范围内R=0.998 9线性关系良好，可以用于GABA浓度的测定，酶标仪法测GABA最低检出限为0.002 8 g/L。

2.5 精密度试验

按方法1.4.4所测得的精密度结果见表2，该方法在低浓度和高浓度都有很好的检测精密度，相对误差及各组的变异系数均小于5%;表明酶标仪法测GABA结果重现性好，精密度高，所得数据准确。

2.6 加标回收率试验

按方法1.4.5所测得的加标回收率数据见表3，由表可知，当加标浓度为检测限的10倍时，加标回收率为92.86% ～106.07%;为检测限的2倍时，加标回收率为83.93% ～105.36%;而为最低检测限时，加标回收率为125.00%。鉴于加入过多或过少标准物质，均不能保证加标样品有较好的回收率并且一般的分析方法适用浓度范围的中、高浓度水平，因此，对0.25、0.75 g/L GABA的加标回收率进行测定，加标回收率为98.27%～103.60%，表明酶标仪法可以用于GABA浓度的测定。

2.7 拟合曲线的建立

按方法1.4.5，分别用可见光分光光度计与酶标仪对75株乳酸菌发酵液中GABA的含量进行测定，并进行拟合，验证两方法之间的相关性，拟合曲线见图6。

表2 精密度试验Table 2 Accuracy examinations

表3 加标回收率Table 3 Recoveries of spiked sample

图6 分光光度计法与酶标仪法的拟合曲线Fig.6 The fitting curve of the spectrophotometer and enzyme-labelling measuring instrument

相关系数的正负表示的是相关的方向，而相关的强度决定于相关系数的绝度值。统计学家根据经验给出了判断相关关系强弱的标准，把R=0.70看成是一个中等到较高的相关［13］。本实验的样本量为75，相关系数R=0.949 3，说明酶标仪法和可见光分光光度计之间具有较高的正相关性，酶标仪法可以作为快速、准确地测定发酵液中GABA含量的有效方法。

3 结论

本实验基于Berthelot反应原理，对酶标仪测定GABA含量方法的主要因素进行优化，并对该方法进行精密度检验，表明酶标仪法测GABA可靠性高。本实验还通过分光光度计与酶标仪对ARTP诱变获得的75株突变株分别进行测值并进行拟合，实验结果表明2种测定方法具有很好的一致性。酶标仪能快速，简便、准确、大批量的测定发酵液中GABA含量，为高通量选育GABA乳酸菌奠定了实验基础。

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