茯苓多酚氧化酶酶学特性及褐变抑制*

陈红梅，谢翎

(安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆，246011)

茯苓，俗称松苓、云苓，为担子菌纲多孔菌科茯苓属(Poria cocos(Schw.)Wolf)，大多寄生于松科植物马尾松或赤松根部，为传统中药，具有利水渗湿、益脾健胃、宁心安神，增强机体免疫等功能［1］。茯苓富含茯苓多糖、茯苓酸、三萜羧酸、月桂酸等成分［2-3］，具有很高的药用和营养价值。安徽省安庆市岳西县隶属于大别山区，是茯苓主要栽培基地［4］，年产茯苓达100多万kg。茯苓深加工产业带动了地方经济的发展，但是，茯苓在加工过程中，较易发生褐变，从而影响了茯苓的外观品质。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，E.C.1.10.3.1)是一种含铜的末端氧化还原酶，广泛存在于植物、动物和微生物体内［5］。多酚氧化酶因能作用于酚，使之转化为醌类物质，醌类物质之间相互聚合生成褐色素，而使植物组织呈现褐色［6-7］，这样，PPO成为植物体内引起酶促褐变的重要因素之一。酶促褐变往往因会影响蔬果的感官品质，而使蔬果的经济价值降低，从而引起了人们对PPO的关注。不同植物，可能因为其品种或生长环境的差异，PPO对酶促褐变的影响也不同。目前，对于马铃薯、莲藕、苹果、香蕉等蔬果中PPO的酶学特性研究较多［8-11］，而关于茯苓PPO的研究却未见详细报道。本研究以茯苓为原料，对茯苓PPO的部分酶学性质包括最适pH值，最适反应温度和底物浓度等进行研究，并探讨抑制剂对PPO活性的影响。通过对茯苓PPO动力学特性的研究，采取有针对性的措施以减少茯苓加工过程中酶促褐变的发生，为优良品质茯苓的深加工提供依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茯苓，取自安徽省安庆市岳西县茯苓种植基地。

丙酮、NaH2PO4、Na2HPO4、邻苯二酚、NaCl、抗坏血酸、L-半胱氨酸、柠檬酸等均为分析纯。

UV-2000紫外可见分光光度计，上海尤尼柯公司;TGL-16G高速冷冻离心机，上海精密仪器有限公司;FA2004A电子天平，上海精天有限公司，数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液的制备

将茯苓用清水洗净，风干，切成小块，准确称取5 g置于组织捣碎机中，加入预冷的丙酮，打成匀浆，抽滤，滤渣经丙酮反复抽滤，得丙酮粉。丙酮粉经风干后，加入pH 7.0的经预冷的磷酸盐缓冲液，在冰浴条件下研成匀浆。匀浆液转入离心管中，于4℃，12 000 r/min离心20 min，上清液即为茯苓PPO粗酶液，备用。

1.2.2 PPO酶活性测定

分别取0.1 mol/L邻苯二酚溶液0.5 mL、pH 5.5的磷酸盐缓冲液3mL置于小试管中，充分混匀后再加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，用分光光度计测定其在420 nm下的吸光度值A。以蒸馏水为对照，每隔5 s读取1次，连续记录2 min。每克样品单位时间内吸光度值增加0.001为1个酶活力单位U。最大酶活力为100%。

1.2.3 PPO最适反应pH值

取0.1 mol/L邻苯二酚溶液0.5 mL于小试管中，再分别加入 pH 分别为 3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9 的磷酸盐缓冲液 3 mL，充分混匀后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，用分光光度计测定其在420 nm下的吸光度变化值。

1.2.4 PPO最适反应温度

取0.1 mol/L邻苯二酚溶液0.5mL于小试管中，再加入最适pH的磷酸盐缓冲液3 mL，充分混匀后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，分别置于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃ 水浴锅中保温 5 min，冷却，用分光光度计测定其在420 nm下的吸光度变化值。

1.2.5 底物浓度对PPO酶活性的影响

分别取浓度为 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L 的邻苯二酚溶液 0.5 mL于小试管中，再加入最适pH的磷酸盐缓冲液3 mL，充分混匀后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，在最适温度下保温5 min，冷却，用分光光度计测定其在420 nm下的吸光度变化值。

1.2.6 PPO热稳定性分析

取最适pH的磷酸盐缓冲液3 mL，加入0.5 mL茯苓 PPO 粗酶液，分别在35、45、55、65、75 ℃保温 0、4、8、12、16、20、24 min，置于冰浴中迅速冷却，用分光光度计测定其在420 nm下的吸光度变化值。

1.2.7 抑制剂对PPO酶活性的影响

取邻苯二酚溶液0.5 mL于小试管中，再加入最适pH的磷酸盐缓冲液3 mL，充分混匀后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，分别加入不同质量浓度的NaCl、抗坏血酸、L-半胱氨酸和柠檬酸溶液1 mL，依次用分光光度计测定在420 nm下的吸光度变化值。

2 结果与分析

2.1 pH值对茯苓PPO酶活性的影响

pH值对茯苓PPO酶活性的影响如图1所示。茯苓PPO酶活性的最适pH值为6.5，高于或低于此值，酶活力均下降。当pH值小于6.5时，随着pH值的增加，酶活性也随之增强;而当pH值大于6.5时，酶活性又随着pH值的升高而下降。PPO酶活性在强酸性和强碱性环境中，酶活性均较低，这主要是因为PPO是一种含铜蛋白，位于PPO酶活性中心部位的辅基Cu2+，在极端酸碱性环境中容易发生解离。当在强酸性环境中，Cu2+发生解离，使酶活性大大下降或失活;当处于强碱性环境中时，解离下的Cu2+容易形成Cu(OH)2沉淀，从而使得酶活性显著降低甚至失活［12］。因此，PPO在酸性或碱性环境中，酶活性受到很大抑制，在一定程度上也能减少酶促褐变的发生。

图1 pH值对茯苓PPO酶活性的影响Fig.1 Effect of pH on PPO activity of Poria cocos

2.2 温度对茯苓PPO酶活性的影响

温度对茯苓PPO酶活性的影响如图2所示。在20～35℃，随着温度的升高，酶活性呈增长趋势，当温度达到35℃时，茯苓PPO酶活性达到最高，茯苓PPO的最适反应温度为35℃。此后继续升高温度，酶活性呈下降趋势。当温度达到75℃时，酶相对活性仅有19.4%。这是因为温度升高，分子碰撞加剧，酶促反应速率也随之加快，但酶的本质是蛋白质，蛋白质的结构与功能是密切相关的。温度稍高会引起蛋白质空间构象发生一定程度的改变，酶活性中心破坏，酶蛋白变性，致使其活性下降甚至引起失活。

图2 温度对茯苓PPO酶活性的影响Fig.2 Effect of temperature on PPO activity of Poria cocos

2.3 底物浓度对茯苓PPO酶活性的影响

底物浓度对茯苓PPO酶活性的影响如图3所示，符合典型的米氏方程曲线。由图3可知，当底物浓度较低时，随着底物浓度的增高，酶活性也随之增高，二者呈一级反应。这是因为底物浓度较低时，只有一部分酶与底物结合，底物浓度决定了反应速率;当底物浓度达到0.06 mol/L时，酶活力几乎保持不变，继续增加底物浓度，反应也趋于稳定状态，二者呈零级反应。这是因为当底物达到一定浓度时，全部跟酶的活性部位结合，酶已经达到饱和，即使再增加底物浓度，也不会使反应速率增加。

图3 底物浓度对茯苓PPO酶活性的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on PPO activity of Poria cocos

根据Line weaver-Burk方程，利用双倒数作图法，以1/［S］为横坐标，1/V为纵坐标作图，如图4所示，拟合得到动力学方程。根据方程，求得茯苓PPO动力学参数，其中米氏常数Km=0.024 4 mol/L，最大反应速率Vmax=121.95 U/min。

图4 茯苓PPO酶促反应双倒数曲线Fig.4 Double reciprocal plot of enzyme-catalyzed reaction of PPO from Poria cocos

2.4 茯苓PPO热稳定性

将茯苓PPO酶置于不同温度下分别处理一段时间，测定其酶活，对其热稳定性分析，结果如图5所示。茯苓PPO酶在35℃时，酶活性较为稳定，随着作用时间的延长，酶活性呈缓慢下降趋势;其次为45℃。而当继续增高至55、65、75℃时，酶活性呈急剧下降趋势。在75℃下作用8 min，PPO已经大部分失活。

2.5 抑制剂对茯苓PPO酶活性的影响

图5 茯苓PPO酶热稳定性Fig.5 Thermal stability of PPO from Poria cocos

在酶的反应体系中，分别加入不同质量浓度的NaCl、抗坏血酸、L-半胱氨酸和柠檬酸溶液，这4种抑制剂对茯苓PPO酶活性的影响如图6所示。NaCl、抗坏血酸、L-半胱氨酸和柠檬酸溶液均对茯苓PPO酶活性具有一定的抑制作用，且抑制效果与抑制剂的质量浓度呈正比关系。在同等质量浓度下，L-半胱氨酸对茯苓PPO酶的活性抑制程度最大，其次是抗坏血酸、柠檬酸，最后是NaCl。L-半胱氨酸质量浓度为0.6 mmol/L时，此时茯苓PPO酶相对酶活只有7%。L-半胱氨酸抑制茯苓PPO酶的活性，可能是因为它可以与醌类物质结合生成硫氢化合物，从而抑制酶促褐变［13］。抗坏血酸对茯苓PPO酶活性也具有较强的抑制作用，可能是因为它具有还原性，可以将PPO酶的辅基Cu2+还原，将醌类还原成酚醛结构，抑制醌类物质相互聚合［14-15］。柠檬酸和NaCl对PPO活性也有一定的抑制作用，但较L-半胱氨酸和抗坏血酸来说，抑制效果相对较差。

图6 不同抑制剂对茯苓PPO酶活性的影响Fig.6 Effect of different inhibitors on PPO activity of Poria cocos

3 结论与讨论

通过对茯苓PPO酶学特性的研究，茯苓PPO酶的最适pH为6.5，最适温度为35℃，最适底物浓度为0.06 mol/L。PPO酶促反应动力学符合米氏方程，米氏常数Km=0.024 4 mol/L，最大反应速率Vmax=121.95 U/min。PPO的耐热性较差，75℃下热处理8 min，可以使酶活性基本失活。NaCl、抗坏血酸、L-半胱氨酸和柠檬酸溶液对茯苓PPO酶活性有一定的抑制作用，在一定质量浓度范围内，抑制效果与质量浓度呈线性关系。其中以L-半胱氨酸抑制效果最好，其次是抗坏血酸，再次是柠檬酸，最后是NaCl。

今后，在茯苓深加工过程中，可以采取一些措施避开PPO酶的最佳反应条件。诸如可以在偏酸性或是偏碱性的环境中，低温下进行操作，抑制PPO活性，延缓褐变;PPO热稳定性较差，热处理一定时间可以使酶活性部分或完全失活，但热处理过程中也容易使茯苓其他的有效成分分解，影响品质，因此不建议使用。另外，在加工过程中可以加入L-半胱氨酸、抗坏血酸等，这些物质都可以抑制PPO的活性，从而减少酶促褐变的发生。在植物加工过程中，这些物质常作为护色剂加入防止褐变的发生［16-17］，均取得了一定的效果。对于抑制剂，有研究表明具有协同作用，同时将几种抑制剂结合使用与只加入其中一种相比较，可能对酶促褐变起到更好的抑制作用，但是，对于茯苓是否不能同样如此，本文并没有作进一步研究。

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