酒花萜烯醇及其立体异构体在啤酒酿造中的检测及其变化研究*

王露，江伟，刘翔，4，王德良，刘玉梅

1(新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐，830046)2(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)

3(中德发酵酒品质与安全国际联合研究中心，北京，100015)4(天津科技大学生物工程学院，天津，300457)

啤酒酿造过程中，酒花是重要原料之一，其中的化学成分主要包括萜烯类和萜烯醇类［1-3］。其中，亲水性较强的萜烯醇(如里那醇、β-香茅醇、α-萜品醇、香叶醇等)，在啤酒中的含量较高［4］，范围在1～100 μg/L(加拿大精酿啤酒中里那醇含量高达393～906 μg/L［6］)，接近或高于其相应的感官阈值［7］，对啤酒酒花香气具有重要的贡献［8］。

萜烯醇在麦汁煮沸及发酵过程会发生一系列的变化［9］。同时，啤酒中同一种萜烯醇因其不同的分子结构及空间构型而存在不同的感官阈值。以里那醇为例，因其在高品质啤酒中的含量高，且香气宜人，已成为目前公认的对啤酒酒花香气具有重要贡献的化合物之一，酒花制品中的 R-(-)-里那醇和 S-(+)-里那醇分布稳定，R 型占 92% ～94%［10-11］。然而，在啤酒酿造过程中R型异构化转变为S型，S型在啤酒中的感官阈值高达180 μg/L，而R型仅为2.2 μg/L，二者相差约 81 倍［11］。Steinhaus等强调，R-(-)-里那醇异构化为S-(+)-里那醇是导致啤酒酒花香气下降的原因之一［12］。除里那醇外，β-香茅醇、α-萜品醇同样存在立体异构体，它们在酿造过程中都伴有异构化现象，往往受酒花品种和不同添加工艺等条件的影响。另一方面，同一种物质的两种构型可能呈现出的香气也有细微差别，如香叶醇呈现类似玫瑰花香及柑橘香，而其顺式同分异构体橙花醇还具有生青味［13］。一些对酒花香气贡献显著的萜烯醇在啤酒中的阈值如表1所示。

目前，关于萜烯醇立体异构体在啤酒酿造过程中变化规律的系统研究较少。2000年，King等采用GC-MS法，尝试利用手性柱分离(-)-α-萜品醇、(+)-α-萜品醇及 R-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇，α-萜品醇两种构型色谱峰得以完全分离，而里那醇两种构型色谱峰却难以实现完全分离［16］。2003年，Steinhaus等采用稳定同位素稀释法，通过两根色谱柱串联的方式，利用高分辨率二维HPGC/MS，实现了对啤酒中R-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇的分离并在线定量分析［12］。该方法的缺点在于成本较高，操作复杂，不易向国内啤酒企业推广普及。本研究采用课题组前期建立的GC-MS分析法，尝试利用一根手性色谱柱，同时测定啤酒酿造过程中，不同香花添加工艺下(R)-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇、(R)-(+)-β-香茅醇、(S)-(-)-β-香茅醇、(+)-α-萜品醇、(-)-α-萜品醇及香叶醇、橙花醇、橙花叔醇、乙酸香茅酯、香叶酸甲酯、乙酸香叶酯，共12种萜烯醇的变化特点，并找出了影响啤酒酒花香气的4种关键性萜烯醇，初步揭示了啤酒酿造过程中其变化规律。

表1 萜烯醇风味描述及感官阈值Table 1 Olfactory descriptions and sensory thresholds of the terpene alcohols in commercial beer

1 材料与方法

1.1 实验所用材料

1.1.1 原料

麦芽:澳麦，由国内啤酒企业提供。

酒花:青岛大花、萨兹，由国内一啤酒企业提供。

1.1.2 仪器与试剂

100 L微型酿造设备(D-8050型)，德国联邦材料试验研究院;Clarus 600型气相色谱质谱联用仪，配EI离子源，PerkinElmer;低温恒温水浴锅，杭州雪中炭恒温技术有限公司;磁力搅拌器，Corning;万分之一天平，Shimadzu。

里那醇、(R)-(-)-里那醇、α-萜品醇、(+)-α-萜品醇、(R)-(+)-β-香茅醇、(S)-(-)-β-香茅醇、香叶醇、橙花叔醇、橙花醇、乙酸香叶酯、乙酸香茅酯、香叶酸甲酯、2-壬醇(内标)。上述试剂均购自Acros公司和Sigma-Aldrich公司，纯度均≥95.0%。

1.2 分析方法

1.2.1 顶空固相微萃取

称取3 g NaCl于20 mL顶空瓶中，加入发酵液或除气啤酒5 mL及内标溶液(顶空瓶中内标最终浓度为20 μg/L)，放入磁力搅拌，加盖密封。将SPME针管穿透顶空瓶隔垫，纤维头置于距离样品表面约20 mm的上部空间，在一定的水浴温度下，以550 r/min搅拌并萃取一段时间后，取出手柄，直接进样，并解析一定时间。所有样品均平行测定3次。

1.2.2 色谱条件

色谱柱类型:RESTEK Rt®-bBEXsa。进样口温度:240℃。不分流进样。柱温:起始温度50℃，10℃/min升至95℃;3℃/min升至120℃;18℃/min升至210℃，保持10 min。载气:氦气(纯度≥99.999%)，流速:1 mL/min，进样方式:采用固相微萃取方式进样，萃取头类型为85 μmPA，解析5 min。

1.2.3 质谱条件

离子源温度:230℃;传输线温度:230℃;电子轰击源:70 eV，比对结果后对酒花香气化合物进行定性，扫描范围:29～300 amu。定性采用全扫描模式(SCAN)，定量采用选择离子扫描模式(SIM)。每个化合物选择1个定量离子，2～3个定性离子。全离子扫描图如图1所示。

图1 Rt®-bBEXsa对12种酒花香气及异构体的全离子扫描图Fig.1 Total ion current chromatogram of 12 kinds of hop aroma and stereoisomers scanned by Rt®-bBEXsa

1.2.4 感官品评分析

品评小组由接受过专业训练的8位品评员组成。

1.3 酿造工艺实验设计方案

在100 L的规模下，参考国内13°P纯生大生产配料糖化工艺，设计不同香花添加工艺以考察萜烯醇及其立体异构体在发酵过程中的变化。香花分别选择在煮沸结束前10 min、回旋沉淀槽及主酵结束后添加，其他酿造工艺和条件按国内一知名啤酒企业的正常工艺进行，添加量如表2所示。

表2 不同香花添加工艺实验设计Table 2 The experiment design of different hopping regimes

2 结果与讨论

2.1 不同香花添加工艺酿造的啤酒比对研究

2.1.1 不同香花添加工艺中萜烯醇及其立体异构体含量对比

表3列出了4种香花添加工艺所酿造的啤酒中萜烯醇及其立体异构体的含量。

其中R-(-)-里那醇含量受香花添加工艺影响较大，煮沸结束、回旋沉淀槽及主酵结束后添加香花工艺可大幅增加啤酒中R-(-)-里那醇的含量，相比煮沸结束前10 min工艺提升4.15～6.42倍，其含量相较于其他萜烯醇同样也占有绝对优势。4种香花添加工艺酿造出的啤酒中里那醇立体异构体之间的比例如图2所示，R-(-)-里那醇占里那醇总量的60% ～89%，含量范围在1.94 ～14.39 μg/L，按阈值2.2 μg/L［14］可计算出 OAV 值。R-(-)-里那醇在 4种工艺下的OAV值为0.88～6.54，表明R-(-)-里那醇对啤酒酒花香气具有重要贡献。煮沸结束前10 min添加香花工艺中，里那醇R/S构型比例最为接近，说明R型异构化严重，这将极大的影响啤酒的酒花香气，导致其品质下降。而采用其他3种工艺不仅增加了里那醇含量，而且异构化程度明显降低，R-(-)-里那醇所占比例超过80%，尤其是主酵结束后添加香花工艺，使R型占总里那醇比例高至89%，OAV值高达6.54，对提高啤酒酒花香气起到了关键性作用。这种由酒花添加工艺所引起的异构化差异与Steinhaus在研究定量里那醇立体异构体过程中得到的结果是一致的［12］。

表3 不同香花添加工艺下啤酒中萜烯醇及其立体异构体的含量μg/LTable 3 Content of terpene alcohols(μg/L)of differernt hopping regimes in beer

从表3可以看出，与里那醇相比，啤酒中香叶醇的含量受香花添加工艺的影响较小，说明香叶醇在糖化高温条件下依旧能够保留在麦汁当中，四种工艺最终保留在啤酒中的含量范围在9.83 ～12.1 μg/L，按其阈值 6 μg/L［7］计算 OAV 值为 1.64 ～2.02，波动较小，在啤酒中的含量仅次于里那醇，对啤酒酒花香气具有重要贡献。

β-香茅醇在酒花中的含量很少，在啤酒酿造过程中大部分由其他物质转化而来。β-香茅醇在麦汁煮沸过程中会发生异构化现象，随着4种工艺的香花添加时间逐渐推后，啤酒中R-(+)-β-香茅醇含量明显增多，主酵结束后添加工艺相比煮沸结束前10 min工艺增加了1.33倍。4种工艺酿造出的啤酒中β-香茅醇立体异构体之间的比例如图3所示，R-(+)-β-香茅醇在4种工艺中占 β-香茅醇总量的66% ～91%，含量范围在2.91 ～6.79 μg/L，说明香花添加工艺对R-(+)-β-香茅醇异构化影响显著，尤其是主酵结束后添加香花工艺，使R型占总β-香茅醇比例高至91%。尽管β-香茅醇OAV值小于1，但对啤酒酒花香气的贡献体现在与里那醇、香叶醇的协同作用［7］，而究竟是R型还是S型更有利于啤酒酒花香气的提高还有待于进一步研究。

图2 不同香花添加工艺啤酒中R-(-)-里那醇和S-(+)-里那醇的组成Fig.2 Composition of(R)-(-)and(S)-(+)-Linalool of differernt hopping regimes in beer

图3 不同香花添加工艺啤酒中S-(-)-β-香茅醇和R-(+)-β-香茅醇的组成Fig.3 Composition of S-(-)and R-(+)-β-citronellol of differernt hopping regimes in beer

啤酒中橙花叔醇在4种香花添加工艺下的变化情况略为反常，煮沸结束前10 min工艺含量最高，高达6.81 μg/L，说明高温更利于橙花叔醇在麦汁中的保留，而另外3种香花添加工艺含量范围在5.34～5.86 μg/L，OAV 值均大于 0.25。

另外，OAV值较低的一些物质如:S-(+)-里那醇、(-)-α-萜品醇、(+)-α-萜品醇、S-(-)-β-香茅醇、橙花醇、香叶酸甲酯、乙酸香叶酯、乙酸香茅酯含量范围在0.01 ～2.8 μg/L，其OAV值小于0.15，说明这些物质对啤酒酒花香气的贡献不显著，4种香花添加工艺对其含量的影响也较小，可忽略不计。

综上所述，R-(-)-里那醇、香叶醇、R-(+)-β-香茅醇、橙花叔醇含量较高且对啤酒酒花香气具有重要贡献，其中R-(-)-里那醇、R-(+)-β-香茅醇含量受香花添加工艺影响较大，因此我们将有针对性的对这4种物质进行酿造过程中的变化规律进一步分析研究。

2.1.2 发酵过程中4种重要的萜烯醇在不同香花添加工艺下的变化规律

在啤酒发酵过程中，萜烯醇及其立体异构体在酵母的作用下会发生生物化学变化，由图4可知，4种香花添加工艺所酿造的啤酒中，R-(-)-里那醇、香叶醇、R-(+)-β-香茅醇、橙花叔醇的含量均高于其各自在冷麦汁中的含量，国外学者指出，这些增加的萜烯醇并非自发产生，也不是完全经由酵母自身代谢而成，而是二者共同作用的结果，即在酵母作用下发生了相互间的转化［16-17］。

如图4A所示，当采用煮沸结束前10 min添加香花工艺进行发酵时，啤酒中R-(-)-里那醇含量不超过2 μg/L，发酵过程中也没有明显的变化趋势，这是由于高温使溶解在麦汁中的R-(-)-里那醇大量挥发，保留下来的量很少，后期通过酵母转化含量略微有所增加。而采用煮沸结束、回旋沉淀槽工艺添加香花时，冷麦汁中的R-(-)-里那醇含量大幅增加。这两种工艺变化趋势基本上相同，发酵前3天内含量不断地积累，3天后又迅速下降，分别低至5.81 μg/L、7.23 μg/L。下降的原因是由于发生了生物化学转化。根据全巧玲的研究结果可知，游离的里那醇很快被酵母利用而减少，转化成α-萜品醇，还产生少量香叶醇［18］。第7天后再次回升，最终啤酒中的含量分别为9.99和12.24 μg/L，这可能是由于酵母对糖苷键的利用释放出了部分与糖苷键相连的R-(-)-里那醇，使其含量有所回升［19-20］。与冷麦汁相比，这两种工艺酿造的啤酒中，R-(-)-里那醇含量分别上升45%、35%。而采用主酵结束后添加香花工艺，情况又有所不同。添加香花之前，该工艺发酵液与煮沸结束前10 min添加香花工艺中R-(-)-里那醇的含量基本持平，而主酵结束(第7天)添加香花后，R-(-)-里那醇含量快速增加，后酵期继续小幅增长使得最终保留在啤酒中的含量高达13.79 μg/L，是该工艺下冷麦汁中含量的10.1倍，说明避开了高温的作用下，酒花中的R-(-)-里那醇能够直接溶解于发酵液中，同时也说明酒花中的R-(-)-里那醇含量很高。JP

如图4B所示，香叶醇与R-(-)-里那醇的变化趋势较为相似。不同之处在于，采用煮沸结束和回旋沉淀槽添加香花工艺时，虽然发酵前3天香叶醇保留在发酵液中的含量明显高于煮沸结束前10 min添加工艺，但是发酵第3天后，这3种工艺条件下的香叶醇含量都开始大幅下降，降至8.30±0.3 μg/L，根据King和Dickinson［13-16］绘制的酵母作用下萜醇转化路径图可知，香叶醇可以转化为β-香茅醇和里那醇。然而，从第7天起，发酵液主酵结束，香叶醇由于某种原因含量又开始回升，部分来自于里那醇的转化［18］。观察主酵结束后香花添加工艺下香叶醇在冷麦汁中的含量可知，此时保留在冷麦汁中的香叶醇完全由苦花赋予，其在高温糖化作用下仍能大量存在，含量高达5.67 μg/L，是此工艺条件下冷麦汁中R-(-)-里那醇含量的4.12倍，说明香叶醇比R-(-)-里那醇在高温条件能更稳定地保留在麦汁当中，还有一种可能是由于青岛大花本身所含有的香叶醇含量很高所致。有学者们认为，香叶醇的含量比里那醇更具有酒花品种特异性［6，21］(即不同的酒花品种，香叶醇含量相差较大)。

对比图4C四种工艺可知，R-(+)-β-香茅醇在冷麦汁中的含量很少，均不超过1 μg/L，随着发酵的进行，前3天内R-(+)-β-香茅醇含量有明显增加，这与发酵液中香叶醇的转化有一定关联。发酵3天后，回旋沉淀槽和煮沸结束添加香花工艺R-(+)-β-香茅醇含量不断下降，根据全巧玲的研究可知，它们部分转化成为了乙酸香茅酯，以及少量香叶醇［18］。而值得关注的是主酵结束后添加香花工艺，添加香花后R-(+)-β-香茅醇在发酵液中的含量并没有大幅度增长，而是继续缓缓上升，证明了酒花中R-(+)-β-香茅醇含量较少，含量的增加是由于其他物质的生物化学转化作用，一直到发酵结束，含量达到6.79 μg/L。Takoi等研究表明，β-香茅醇含量在发酵后期的含量增加并非是简单的香叶醇含量迅速下降直接转化而来的结果，这其中可能还存在一些尚不明确的途径［7］，4种香花添加工艺在主酵结束后(第七天)R-(+)-β-香茅醇含量均缓慢增加，据文献记载，Lager酵母在发酵后期细胞膜的通透性增加，外切1，4-糖苷酶被分泌到细胞外，糖苷酶可以将部分结合态存在的萜烯醇水解成相应的游离态［17，22］，从而可能促使R-(+)-β-香茅醇含量增加。

图4 发酵过程中不同香花添加工艺下4种萜烯醇的含量变化(μg/L)Fig.4 Comparison of four terpene alcohols(μg/L)during fermentation of differernt hopping regimes in beer

如图4D所示，橙花叔醇在4种香花添加工艺下的变化趋势基本一致，而较为反常的是，发酵进行到第3天时，主酵结束后添加香花工艺的橙花叔醇含量略高于其他3种已添加了香花的工艺。而主酵结束后(第7天)添加了香花，该工艺却并没有因为新添加了香花使橙花叔醇的含量再度增加，这可能是由于酒花本身所含有的橙花叔醇含量就很低所致。直到发酵液主酵结束，四种工艺中橙花叔醇含量基本一致，均高于 5 μg/L。

综上所述，R-(-)-里那醇、R-(+)-β-香茅醇、香叶醇在主酵结束后添加香花工艺条件下，含量均最高，相较于煮沸结束前10 min添加香花工艺分别提高6.42、0.19、1.33倍，其次是回旋沉淀槽添加香花工艺，煮沸结束和煮沸结束前10 min添加香花工艺含量相对较低。而橙花叔醇在煮沸结束前10 min添加香花工艺中含量最高，而主酵结束后、煮沸结束、回旋沉淀槽添加香花工艺含量较低且相差不显著。

2.2 感官品评

香花添加工艺对啤酒中的萜烯醇及其立体异构体含量影响较大，结合感官品评方式对啤酒做出评价，并对香气进行描述，可确定出最佳的香花添加工艺。图5给出了品评小组针对5种香气(花香、柑橘香、生青味、酒花味、苦味)及协调性的综合评分。

煮沸结束前10 min添加香花工艺感官评分数各项都较低，酒花香气不明显，整体协调性也欠佳。另外3种工艺评分较高，且分数较为接近。综合得分最高的是回旋沉淀槽添加香花工艺，其中R-(-)-里那醇、香叶醇、R-(+)-β-香茅醇含量均较高，以该工艺添加香花，可能有助于其累加协同作用，使酿造出的啤酒香气明显，富含花香及典型柑橘香，整体协调性最佳。采用主酵结束后添加香花工艺，使萜烯醇及其立体异构体最大程度的保留在麦汁当中，但生青味较为明显，这可能与R-(+)-β-香茅醇含量过高有关。本研究在测定酒花香气阈值时，品评小组普遍反映:当 R-(+)-β-香茅醇含量在 8 μg/L 左右，会给啤酒带来香气的同时，加重啤酒的生青味及苦涩感，采用主酵结束后添加香花工艺时R-(+)-β-香茅醇含量达6.79 μg/L，使得整体的协调性受到了影响。因此，本研究香气综合评分中，4种工艺效果由高到低分别为回旋沉淀槽＞主酵结束后＞煮沸结束＞煮沸结束前10 min(试验前3者差异较小)。

图5 不同香花添加工艺酿造的啤酒感官风味轮廓Fig.5 Flavour profile of sensory evaluation of differernt hopping regimes in beer

3 结论

本文采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱技术(HS-SPME/GC-MS)，跟踪检测了啤酒酿造过程中源自酒花的12种香气物质，包括(R)-(-)-里那醇、S-(+)-里那醇、(R)-(+)-β-香茅醇、(S)-(-)-β-香茅醇、(+)-α-萜品醇、(-)-α-萜品醇及香叶醇、橙花醇、橙花叔醇、乙酸香茅酯、香叶酸甲酯、乙酸香叶酯，对比研究不同的香花添加工艺，发现R-(-)-里那醇、香叶醇、R-(+)-β-香茅醇、橙花叔醇含量较高且对啤酒酒花香气具有重要贡献，它们在4种工艺下酿造的啤酒中含量最高分别可达14.39 μg/L、12.10 μg/L、6.79 μg/L、6.81 μg/L，OAV 值范围在 0.29 ～6.54。前3者在主酵结束后添加香花工艺中含量最高，其次是回旋沉淀槽添加香花工艺。而高温更利于橙花叔醇在麦汁中的保留，煮沸结束前10 min添加香花工艺中其含量最高。4种重要的萜烯醇在发酵过程中，受不同香花添加工艺影响下遵循一定的变化规律。

将检测结果和感官评品结合对4种香花添加方式进行对比，发现4种工艺效果由高到低分别为:回旋沉淀槽＞主酵结束后＞煮沸结束＞煮沸结束前10 min，回旋沉淀槽添加香花工艺综合得分最高，使啤酒富含酒花香气，该工艺更有利于提高国产啤酒酒花香气，打造具有典型酒花香气的优质啤酒。

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