HPLC测定甘草酸二铵原料药中的有关物质

崔素梅，曹 方，蒋艳霞，霍建富(山西康宝生物制品股份有限公司，长治 046011)

甘草酸二铵是从甘草中提取的a体甘草次酸衍生物，具有抗炎、抗变态反应、抗病毒、保护细胞结构、调节免疫、改善肝功能等多种作用。近年来随着临床研究的不断深入，其应用范围不断拓宽［1］，临床价值极大。因此甘草酸二铵制剂的质量，密切关系到人民群众的用药安全，甘草酸二铵原料药作为制剂的源头，把好质量关十分必要。

甘草酸二铵原料药的质量标准包括四方面，检查项通常应考虑安全性、有效性和纯度三方面的内容。有关物质的检测作为检查项下的重要指标，对甘草酸二铵原料药的质量控制起到十分重要的作用。甘草酸二铵原料药的国家药品标准［2］中并未收入有关物质检查项目，但由于本品组成复杂，为保证产品批间质量的一致性和安全性，有必要建立一种专属性强、灵敏度高的有关物质的检测方法，并确定其质量标准。

1 仪器与试药

仪器:岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-M10Avp紫外检测器。色谱柱:Apollo C18柱(250 mm ×4.6 mm，φ5 μm)。进样量:20 μl，试验试剂:乙腈为色谱级，磷酸二氢钾、磷酸为分析纯，水为纯化水。

试药:原料药样品批号:130401、130402和130403，均为山西康宝生物制品股份有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的建立

参照文献［3，4］的高效液相色谱法建立了甘草酸二铵高效液相色谱条件。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值为3.0)(40∶60)为流动相;检测波长252 nm。理论塔板数按甘草酸二铵峰计算应不低于2 000，在此液相色谱条件下主成分峰与相邻杂质峰的分离度良好，符合药典要求，使甘草酸二铵与其可能存在的杂质及降解产物达到完全分离。

2.2 溶液的制备

供试品溶液的制备:精密称取甘草酸二铵原料25 mg，置50 ml容量瓶中，精密加入流动相制成含量为500 μg/ml的溶液，摇匀，即得。

自身10%对照溶液的制备:精密量取供试品溶液稀释10倍，即得含量为50 μg/ml的溶液，摇匀。

测定法:精密量取对照溶液20 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%-25%。再精密量取对照液和供试液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍;供试品色谱图中如显杂质峰，各杂质的峰面积之和不得大于对照溶液主成分峰面积的10.0%。

2.3 方法学研究

2.3.1 波长的选择 精密称取甘草酸二铵适量，加流动相溶解并稀释至适当的浓度，用紫外分光光度计按分光光度法［3］在200-400 nm扫描，结果甘草酸二铵在252 nm±2 nm有最大吸收;由于得不到杂质对照品，并且在预试验过程中发现，在此波长处用HPLC法检测杂质明显，因此我们将测定波长选为252 nm。

2.3.2 流动相的选择 分别使用乙腈、0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值为3.0±0.05)，按不同比例配制流动相，42∶58为流动相1;35∶65为流动相2;40∶60为流动相3。

结果显示，选用流动相1，出峰太早，甘草酸二铵与杂质峰未完全分离。考虑改变流动相极性，得流动相2，采用流动相2显示，甘草酸二铵与杂质完全分离，但出峰时间太晚。继续改变乙腈的比例得流动相3，结果主峰保留时间合适，主峰与杂质峰分离良好。确定流动相条件为流动相3。

2.3.3 空白溶剂试验 精密吸取流动相20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果显示流动相不影响有关物质的检查。

2.3.4 专属性试验 精密称取甘草酸二铵原料25 mg，加流动相溶解并稀释至50 ml，作为破坏性试验的贮备溶液。分别以下列条件试验:①酸破坏试验:量取甘草酸二铵贮备溶液2 ml，加1 mol/L盐酸1 ml，在热水浴中放置3 h，放凉后用1 mol/L NaOH中和，作为酸破坏样品溶液。②碱破坏试验:量取甘草酸二铵贮备溶液2 ml，加1 mol/L氢氧化钠1 ml，在热水浴中放置3 h，放凉后用1 mol/L盐酸中和，作为碱破坏样品溶液。③氧化破坏试验:量取甘草酸二铵贮备溶液2 ml，加30%双氧水1 ml，放置60 min，然后加热少许，破坏掉溶液中残余的双氧水，放凉后作为氧破坏样品溶液。④光照破坏试验:量取甘草酸二铵贮备溶液2 ml，在(4 500±500)Lx照度下照射6 h。⑤高温破坏试验:量取甘草酸二铵贮备溶液适量，在沸水浴中加热3 h，放凉后作为高温破坏样品溶液。分别量取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。氧化破坏试验条件下，图谱中未见有新杂质峰产生，原杂质含量增加。其他试验条件下，图谱中未见明显的新杂质峰产生，原杂质数目和含量未见增加。

经破坏试验表明:本品在酸性、碱性、光照、高温条件下较稳定;在氧化条件下不稳定。各供试液中杂质与主峰的分离良好，分离度符合要求。

2.3.5 检出限 取2.2项下的供试品溶液，进行逐级稀释，进样，记录色谱图，至主峰峰高约为基线噪音的3倍时，此进样量为本品的最低检出限。结果 表明:甘草酸二铵最低检测浓度为0.1 μg/ml，计算其最低检出量为2.0 ng。

2.3.6 溶液稳定性试验 取供试品适量按上述测定方法配制成浓度为500 μg/ml的溶液，在室温下分别放置 0，4，8，12，24 h，精密量取 20 μl注入色谱仪中，每个时点重复进样3次，记录色谱图，结果见表1。

表1 甘草酸二铵溶液的稳定性试验结果Table 1 The stability results of diammonium glycyrrhizanate solution

结论:甘草酸二铵主峰峰面积基本一致，相对标准偏差小于2.5%，未见有新杂质出现，说明本品溶液在室温下至少24 h之内稳定，可满足含量测定的需要。

2.3.7 精密度试验 取供试品适量按上述测定方法配制成浓度为500 μg/ml的溶液，精密量取20 μl注入色谱仪中，连续进样5次，记录色谱图，结果显示甘草酸二铵主峰峰面积RSD值小于1.0%(见表2)，说明本法精密度良好。

表2 甘草酸二铵重复性试验结果Table 2 The repeatability resu lts of diammonium glycyrrhizanate solution

2.3.8 有关物质测定 取2.2项下配制的供试品溶液和对照品溶液，按2.2项下的测定方法测定，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得超过5.0%，除单个杂质峰外，其他杂质峰面积之和不得超过 5.0%(见图1，2)。

图1 甘草酸二铵溶液有关物质检查色谱图Figure 1 High performance liquid chromatograms of the related substances of diammonium glycyrrhizanate solution

图2 甘草酸二铵溶液有关物质检查10%自身对照色谱图Figure 2 High performance liquid chromatograms of the related substances of 10%diammonium glycyrrhizanate solution

2.3.9 三批样品有关物质测定结果 取三批样品按2.2项下的方法测定，结果显示三批样品的最大杂质为3.40%，其他杂质总和为3.35%(见表3)，可见增加有关物质检查项目很有必要，3批样品的有关物质均小于10.0%，考虑到本品的起始原料为中药材的提取物以及将来生产的实际，我们标准中限定有关物质为不得高于10%。

表3 三批样品中有关物质检查结果Table 3 The test results of the related substances in three batches of samples

3 讨论

用HPLC法测定甘草酸二铵原料药的有关物质，用紫外分光光度法扫描，确定检测波长为252 nm，试验比较了多种比例的流动相，以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值为3.0)(40∶60)为流动相;分离效果较佳，保留时间适宜，分离度大于1.5。该方法简便可靠，精密度高，分离度好，专属性强，可用于甘草酸二铵原料药的有关物质的质量控制。

由于该产品是从中药甘草中提取的，组成复杂，杂质种类较多，含量高，采用自身10%对照法检测有关物质有利于控制产品质量。3批样品的检测，有关物质均小于10.0%，我们标准中限定有关物质为不得高于10%。

［1］赵蓉，吕凌.甘草酸二铵药理研究和临床应用进展［J］.亚太传统医药，2008 4(3):31-36.

［2］国家药品监督管理局.家药品标准［S］.北京:人民卫生出版社，2004:84-85.

［3］ 国家药典委员会.中国药典二部［M］.2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:29-31，23-24.

［4］张敏娟.RP-HPLC测定注射用复方甘草酸苷中甘草酸铵含量和有关物质［J］.药物分析，2008，28(5):798-800.