不同分子量水牛乳酪蛋白酶解肽抗氧化活性的研究

李玲，曾庆坤，林波，唐艳，农皓如，黄丽，谢芳

(中国农业科学院广西水牛研究所，南宁530001)

0 引言

制备高含量的活性肽产品，开发高营养、易吸收且具有生物学活性的乳肽产品，是乳品研究开发的重要方向[1-2]。活性肽的分离纯化是一个较为复杂的过程，超滤膜分离是通过选择一定截留分子量大小的超滤膜，对多肽的分子量进行初步分级，以得到一定分子量范围的多肽。本文对实验室自制的水牛乳酪蛋白酶解粗多肽进行透析脱盐，并根据其分子量分布，超滤得到不同分子量范围的肽组分，测定不同分子量范围肽的抗氧化活性，以明确高活性肽的分子量范围，为纯肽段的分离纯化及鉴定奠定基础。

1 材料与设备

DPPH（Sigma-Aldrich），Tris（Solarbio），铁氰化钾，三氯化铁，盐酸，邻二氮菲，无水乙醇，七水合硫酸化亚铁，过氧化氢，EDTA，邻苯三酚，磷酸二氢钠，三氯乙酸均为分析纯。水牛乳酪蛋白粗多肽1号，碱性蛋白酶酶解肽，实验室自制。MWCO100D透析袋（美国光谱），MSC300超滤杯以及超滤膜，紫外分光光度计（美国Perkin Elmer）。

2 实验方法

2.1 脱盐及超滤分级流程

整体试验设计流程如图1所示。由图1可以看出，对实验室自制的水牛乳酪蛋白酶解粗多肽1号进行透析脱盐，得到脱盐后的多肽2号，测定多肽2号的分子量分布，选择适宜的超滤膜，超滤后得到多肽3号以及多肽4号，测定不同分子量范围肽组分的抗氧化活性。

图1 脱盐及超滤分级流程

2.2 脱盐方法

将粗多肽1号配制成10%的溶液置于MWCO 100D透析袋中，浸泡在去离子水中于4℃下透析，每2 h换一次水，24 h后，将其进行冷冻干燥得到多肽2号样品。

2.3 分子量分布测定方法

采用高效液相色谱法，参考陈园园等[3]。

2.4 超滤方法

将多肽2号配制成5%水溶液，在超滤杯中安装超滤膜，控制压力，超滤过程保持最大工作压力0.22 MPa，得到不同分子量范围的多肽。收集滤出液并浓缩、冷冻干燥，得到多肽3号与多肽4号。

2.5 抗氧化活性测定方法

（1）清除DPPH自由基的能力参考李玲等[4]方法。

（2）清除羟基自由基的能力参考陈学勤等[5]方法。

（3）清除超氧阴离子的能力参考汪建斌等[6]方法。

（4）还原能力参考Oyaizu等[7]的方法。

3 结果与分析

3.1 透析脱盐

透析的目的是对得到的粗多肽进行简单的纯化，降低由于盐的存在而对超滤分级和抗氧化活性实验的影响。透析实验后得多肽2号的盐质量分数为3.62%，相比于粗肽1号盐质量分数为20.91%，脱盐率为82.96%，此时多肽2号的肽质量分数大于80%。

3.2 多肽2号分子量分布

测定水牛乳多肽2号的分子量范围，为超滤分级中超滤膜的选择提供数据参考。多肽2号的分子量分布如图2与表1所示。由图2和表1可以看出，99.9%的肽分子量小于3 ku，其中小于2 ku的达到99.14%，大于1 ku的达到89.04%，说明本实验室自制的水牛乳酪蛋白酶解肽，水解充分，得到的肽分子量较低。根据多肽2号的分子量分布情况，选择截留分子量为1 ku的超滤膜对不同分子量的多肽进行超滤分级，得到分子量小于1 ku和大于1 ku（1～3 ku）的两个组分，命名为多肽3号和多肽4号。

图2 多肽2号分子量分布

3.3 各分子量范围肽组分抗氧化活性

天然产物的抗氧化活性需采用多种实验系统进行综合评价，而使用自由基捕获体系，通常选用2-3种不同的自由基体系来考察抗氧化剂的自由基捕获能力，本研究采用了DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和超氧阴离子清除能力，结合还原能力，测定对比2.5，5.0，10.0，20.0 mg/g不同质量分数下，多肽3号与多肽4号的抗氧化能力，并以强抗氧化剂维生素C以及酶解肽的乳源蛋白，即水牛乳酪蛋白为对照。

表1 多肽2号分子量定量分布

图3 DPPH自由基清除能力的比较

图4 羟基自由基清除能力的比较

图5 超氧阴离子清除能力的比较

图6 还原能力的比较

清除DPPH自由基能力的测定结果如图3所示。由图3可以看出，相同质量分数下，清除能力的大小依次为Vc＞多肽3号＞多肽4号＞酪蛋白。除羟自由基能力的测定结果如图4所示。由图4可以看出，相同质量分数下，清除能力的大小依次为多肽3号＞Vc＞多肽4号＞酪蛋白，当质量分数达到20 mg/g时，多肽3号的清除率达到94.78%，远大于酪蛋白，甚至高于Vc。超氧离子清除率的测定结果如图5所示。由图5可以看出，清除率大小依次为：Vc＞多肽3号＞多肽4号＞酪蛋白，质量分数为20 mg/g时多肽3号的清除率达到50.33%，相比于抗坏血酸明显偏低。还原能力测定结果如图6所示。由图6可以看出，相同质量分数的抗氧化剂中，还原能力大小依次为Vc＞多肽3号＞多肽4号＞酪蛋白，质量分数为20 mg/g时，小于1 ku多肽的A值达到1.0091，水牛乳多肽的还原能力介于Vc和酪蛋白之间，其还原能力明显高于酪蛋白，且分子量范围越小，还原能力越大。

抗氧化活性测定结果表明：水牛乳酪蛋白酶解肽对DPPH自由基以及羟基自由基的捕获能力较强，对清除超氧离子的捕获能力相对较弱，其中多肽3号抗氧化活性高于多肽4号，且通过方差分析质量分数为20 mg/g时各分子量肽组分与酪蛋白抗氧化活性的差异，表明二者各抗氧化指标均显著（P＜0.05）高于底物酪蛋白。董江涛等人[8]研究表明，分子量分布在1 ku以下的大豆多肽抗氧化能力表现较高，原因可能是小分子的多肽活性位点或基团更多地暴露在外，能充分与自由基等结合，所以多肽分子量的大小与抗氧化性有密切的联系。目前已经从乳蛋白酶解物中分离得到的纯肽段的分子量也多在1 ku以内，如，Suetsuna K等[9]得到的 YFYPEL，FYPEL，YPEL，PEL，EL 肽段；Contreras等[10]得到的LQKW，LDTDYKK肽段，刘志东等[11]得到的HIR肽段。本研究对不同分子量范围的水牛乳酪蛋白酶解肽的抗氧化活性研究也表明，分子量在1 ku以内的肽段，其DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除能力以及还原能力均明显强于分子量在1 ku以上的肽段（1～3 ku）。

4 结论

制备的水牛乳酪蛋白酶解肽分子量均小于3 ku，通过超滤对多肽分子量分级后，分子量在1 ku以内的水牛乳酪蛋白酶解肽，其DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除能力以及还原能力均强于分子量在1 ku以上的肽段（1～3 ku），且显著高于（P＜0.05）酶解前的底物酪蛋白。

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