影响植物乳杆菌T102生长与产细菌素能力的因素

徐莹，梁红敏

（包头轻工职业技术学院乳品工程学院，内蒙古，包头014035）

0 引言

细菌素是由一类具有抑菌活性的蛋白质或多肽，其抑菌范围不仅仅局限于亲缘关系较近的种，而且，产生细菌素菌株对该细菌素具有自身免疫性[1-2]，能够抑制腐败菌和致病菌的生长。如今，国内外已分离鉴定到多种产细菌素的乳酸菌菌株，有些乳酸菌素作为食品防腐剂被广泛用于工业生产[3]。细菌素的产生一般与菌株的生长情况有关[4-6]。同时,细菌素的产量还受菌株的培养条件和培养基成分等多种因素影响。

植物乳杆菌T102是从中国自然发酵香肠中分离筛选到具有较强产细菌素能力的乳酸菌菌株，对影响植物乳杆菌T102菌株生长与产细菌素的因素进行研究，对进一步开发利用该菌株细菌素具有重要意义。

1 实验

1.1 材料与设备

菌株为植物乳杆菌T102（实验室从自然发酵香肠中分离鉴定所得）；指示菌为金黄色葡萄球菌（来自实验室保存）。

培养基为MRS培养基和LB培养基[7]。

设备：SPX-250B-Z生化培养箱，HS-840u超净工作台，Acculab电子分析天平，722s紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性实验

采用改良的琼脂扩散法[8]测定抑菌活性，以金黄色葡萄球菌为指示菌。发酵液以8 000 g离心20 min得到发酵上清液，调节pH值为7.0，上清液中加入质量浓度为600 g/L硫酸铵饱和溶液在4℃下震荡过夜，已脱盐的溶液过0.22 μm滤膜得到细菌素溶液。粗提的细菌素连续稀释备用。制备质量浓度为8 g/L琼脂的LB培养基，灭菌后冷却至50℃，接入金黄色葡萄球菌（106mL-1），混匀后倾倒平板，取50 μL上述细菌素溶液于平板上，在37℃下培养48 h。细菌素效价采用标准曲线法测定[9]。

1.2.2 植物乳杆菌T102生长量及活菌数

测定方法：用722s分光光度计在600 nm处，测接种的MRS液体培养基的吸光值（OD值），活菌数采用平板计数法测定。

1.2.3 培养条件对菌株生长及产细菌素能力的影响

（1）培养温度的影响。培养基pH值不变，分别在20，25，30，37，45 ℃5个温度下培养24 h，测OD值及细菌素效价。

（2）培养基初始pH值的影响。用浓度为6 mol/L的HCl或NaOH调pH值为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，121℃灭菌15 min，30℃下培养24 h，测OD值及细菌素效价。

1.2.4 培养基营养成分对菌株生长及产细菌素能力的影响

在MRS基础培养基中，分别替换其中的碳源、氮源，添加不同浓度的KH2PO4、NaCl和吐温-80，在培养基初始pH值为6.0，30℃下培养24 h，测定OD值、细菌素效价及植物乳杆菌T102的活菌数。以MRS基础培养基为正常对照组。

2 结果与分析

2.1 培养条件对菌株生长及产细菌素能力的影响

2.1.1 温度的影响

培养基pH值不变，分别在不同温度下培养24 h，测定OD值及细菌素效价。结果如图1所示。

图1 培养温度对菌株生长及产细菌素能力的影响

由图1可以看出，培养基pH值一定的条件下，不同温度培养时，植物乳杆菌T102菌株的生长和产细菌素的能力有很大的不同。在37℃时，菌株达到最大生物量时，所产细菌素的生物活性却没有在30℃时的高。这说明菌株最适生长温度并不是细菌素活性最大时的温度，这与一些资料报道的某些细菌素在低于最适生长温度下反而细菌素产量较高相符合，说明细菌素的产生或许是一种应激机制，对不适应于其最佳生长环境的一种应激反应[10-11]。菌株T102在30℃培养24 h细菌素效价最高可达590 IU/mL，在20℃时没有检测到细菌素的产生，而且菌株在该温度下生长速度缓慢。

2.1.2 培养基初始pH值的影响

将MRS培养基初始pH值分别调至4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，8.0和9.0，30 ℃下培养24 h后，测定菌体生长量及细菌素效价，结果如图2所示。

由图2可以看出，培养基初始pH值对细菌素的产生有明显的影响。初始pH值为6.0时，培养24 h后菌株产细菌素达到最高产量，为589 IU/mL,初始pH值为7.0，在培养24 h后，菌株的生物量达到最高，但细菌素效价低于初始pH值为6.0的效价，初始pH值为5.0和8.0的菌株生长缓慢，且只有少量的细菌素检出，初始pH值为4.0和9.0的无抑菌活性检出。这说明菌株细胞的生长与细菌素的产生并不是完全成比例，细菌素在一定的pH值条件下才会合成，偏酸或偏碱都不利于细菌素的产生，这可能与细菌素的合成机制有关。

图2 初始pH值对菌株生长及产细菌素能力的影响

2.2 培养基营养成分的影响

2.2.1 碳源的影响

在培养基中加入质量分数2%的不同碳源，30℃培养24 h后,分别测定活菌数、菌体生长量及细菌素效价。结果如表1所示。

表1 碳源对菌株生长及产细菌素能力的影响

由表1可以看出，不同碳源对菌株生长和细菌素的产生具有较大的影响。添加果糖、乳糖、麦芽糖的培养基，植物乳杆菌T-102的活菌数、生长量和效价值都比正常对照值高，其中，乳糖是最易利用的碳源，菌株生长和合成细菌素的能力都最强，该菌株对蔗糖和淀粉的能力较弱，菌株虽然也可以利用蔗糖和淀粉但是生长和合成细菌素能力较低。

在以乳糖为培养基碳源的基础上,又研究了乳糖浓度对菌体生长及细菌素素合成的影响.在培养基中加入不同质量分数的乳糖,培养24 h后,测定活菌数、菌体生长量及细菌素活性.结果如表2所示。由表2可以看出，2.5%的乳糖对菌体生长和细菌素的合成效果最好。

表2 乳糖浓度对菌株生长及产细菌素能力的影响

2.2.2 氮源的影响

在培养基中加入质量分数为2%的不同氮源,30℃培养24 h后,分别测定活菌数、菌体生长量及细菌素效价。结果如表3所示。

表3 氮源对菌株生长及产细菌素能力的影响

由表3可以看出，与其他氮源相比，牛肉膏和酵母提取物的菌体生长量与合成细菌素的能力都比正常值要高，酵母提取物是最易利用的氮源，活菌数、菌体生长量和成和细菌素的能力都最高，菌株虽然也能利用酪蛋白，但是菌株的活菌数和合成细菌素的能力都明显较低。氮源的种类影响细菌素的产量，这可能与细菌素合成机制有关，可能某些氮源中丰富的成分诱导了细菌素基因的启动[12]。

在以酵母提取物为培养基氮源的基础上,研究酵母提取物浓度对菌体生长及细菌素素合成的影响.在培养基中加入不同浓度的酵母提取物,培养24 h后,测定活菌数、菌体生长量及细菌素活性.结果如表4所示,可以看出，2.0%酵母提取物对菌体生长和细菌素的合成能力最好。

表4 酵母提取物质量分数对菌株生长及产细菌素能力的影响

2.2.3 KH2PO4的影响

在培养基中分别加入质量分数为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的KH2PO4,30℃培养24 h后，分别测定活菌数、菌体生长量及细菌素效价。结果如表5所示。

表5 KH2PO4浓度对菌株生长及产细菌素能力的影响

由表5可以看出，质量分数的不同，菌株的生长和产细菌素能力有所不同，除了2.5%生长量低于正常对照组外，其他浓度的KH2PO4，活菌数、菌体生长量和效价都比正常对照值要高，其中质量分数为2.0%的KH2PO4最有利于菌体生长和合成细菌素，质量分数为2.5%的KH2PO4合成细菌素的能力下降。

2.2.4 NaCl的影响

在培养基中分别加入质量分数为0.5%，1.0%，3.0%，5.0%的NaCl,30℃培养24h后,分别测定活菌数、菌体生长量及细菌素效价。结果如表6所示。

表6 NaCl质量分数对菌株生长及产细菌素能力的影响

由表6可以看出，添加NaCl对菌株生长和细菌素合成能力都有影响。0.5%和1.0%的活菌数、菌体生长量和效价都比正常对照值要高，其中1.0%NaCl最有利于菌体生长和合成细菌素。质量分数为3.0%的NaCl虽然菌株能够正常生长，但合成细菌素的能力下降，质量分数为5.0%的NaCl活菌数和菌体生长量和效价较正常值低，不利于菌株的生长，产细菌素的能力明显下降，因此，较高的NaCl浓度阻碍菌株生长和产细菌素。

2.2.5 吐温-80的影响

在培养基中分别加入质量浓度为0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L的吐温-80,30℃培养18 h后,分别测定活菌数、菌体生长量及细菌素效价。结果如表7所示。

表7 吐温-80对菌株生长及产细菌素能力的影响

由表7可以看出，不添加吐温-80，菌体可以正常生长，但是却没有产生细菌素。与其他浓度吐温-80的相比，质量浓度为1.0 g/L的吐温-80合成细菌素的能力都最高，菌体生长没有明显的差异，说明吐温-80对细菌的生长没有促进作用，但是对细菌素的产生却有重大的影响。吐温-80的浓度越大，菌体生长量与合成细菌素的能力反而降低。吐温-80是一种乳化剂，它可以降低菌体与培养基接触面之间的表面张力，从而改善乳酸菌细胞膜的通透性，促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外，因而促进细菌素的产生从而使细菌素的活力增强[13]。

3 结论

在培养基pH值不变的条件下，30℃时的细菌素活性较高，而37℃时菌体的生长量最大，在20℃时没有检测到细菌素的产生，而且菌株在该温度下生长速度缓慢。在培养基初始pH值为6.0时菌体生长量较低，但是细菌素活性要高于pH值为7.0的培养基,初始pH值为4.0和9.0的无抑菌活性检出。乳糖合成细菌素的能力最强，菌株虽然也可以利用蔗糖和淀粉但是合成细菌素能力较低。酵母提取物是最易利用的氮源，活菌数、菌体生长量最大的同时合成细菌素的能力也最高。分别添加质量分数为2.5%乳糖、2.0%酵母提取物、2.0%的KH2PO4和1.0%的NaCl最有利于菌体生长和合成细菌素。吐温-80没有显著促进菌株生长的作用，但是对细菌素的合成具有很大的影响，质量浓度为1.0 g/L的吐温-80合成细菌素的能力最高。本研究有助于深入了解培养条件和培养基营养成分对植物乳杆菌T102生长及产细菌素能力的影响，但是还需进一步进行植物乳杆菌T102发酵产细菌素的条件优化，使植物乳杆菌T102细菌素能够得到广泛应用。

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