双孢菇深层发酵工艺优化的研究

刘晓鹏，姜 宁，马 琼，杨 洪，余丽琼，张 驰

(1．湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000;2．生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北恩施445000)

双孢菇(Agaricus bisporus)属于真菌界、担子菌门、无隔担子菌纲、伞菌目、伞菌科、蘑菇属，又名口蘑、洋蘑菇、白蘑菇、圆蘑菇。双孢菇的野生资源分布于欧洲、北非、北美洲和澳大利亚等地［1］。

双孢菇营养价值高，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质，蛋白质含量可达40%，含有多种氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸，赖氨酸和亮氨酸含量丰富，含有丰富的维生素［2-3］。双孢菇为药食同源的食用菌，味甘性平，具有降血压、提神消化的作用。常食用双孢菇，能预防坏血病、肿癌，促进伤口愈合，并对肝炎、肝硬化具有辅助疗效［4-8］。将双孢菇的多糖、活性肽、氨基酸等活性成分提取出来可开发为药物或保健品。

双孢菇菌盖表面没有保护结构，不能阻止外界的物理伤害、微生物侵染，加之双孢菇呼吸速率高及含水量多，使得双孢菇极易腐烂和褐变［9］，不利于双孢菇生理活性物质的提取获得，而且子实体的人工栽培周期长，费工费时。利用液体深层培养菌丝体具有培养周期短、标准化操作、规模化生产等优点，通过液体发酵可以快速得到双孢菇的菌丝体和生理活性物质，毛勇等［10］研究了碳源、氮源、无机盐对双孢菇胞外多糖产量的影响，王敏等［11］研究了不同碳氮源对双孢菇深层发酵的影响，目前尚未见有系统研究双孢菇深层发酵工艺的报道。

本研究通过对双孢菇深层发酵工艺的优化，为大规模发酵双孢菇获取菌丝体和生理活性物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 由市售的新鲜双孢菇子实体中分离所得，经姜宁副教授鉴定为双孢菇(Agaricus bisporus)。培养基配方 固体斜面种子培养基:马铃薯20%，蔗糖2%，琼脂2%，pH自然。活化培养基:同斜面培养基。液体种子培养基:马铃薯20%，葡萄糖1%，麦芽糖 1% ，MgSO40．15% ，K2HPO40．1% ，pH7．0。

HZQ-F100全温振荡培养箱 大仓市实验设备厂;SPX-250B生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;SW-CJ-2F洁净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司;YXQ-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;电热恒温干燥箱 上海福玛实验设备。

1.2 实验方法

1．2．1 工艺流程 菌种活化→液体种子→液体发酵→过滤发酵液，得菌丝体→清洗菌丝体→干燥→称菌丝干重

1．2．2 操作步骤 在无菌条件下，用接种铲从斜面菌种上切取1cm2的菌块接种至PDA斜面培养基上，26℃恒温培养6d，挑选菌丝洁白、粗壮、浓密、无污染的斜面作为供试菌种。按上述步骤将斜面种子接至液体种子培养基上，26℃恒温振荡培养6d。吸取一定量的液体种子接入发酵培养基，26℃、120r/min培养6d。将发酵醪用4层纱布过滤，并用蒸馏水进行反复冲洗，105℃烘2h，冷却后称重，再放入105℃中烘30min再称重。直至两次称重的重量差不超过2mg即为恒重。

1．2．3 液体培养基优化

1．2．3．1 单因素实验 以可溶性淀粉3%、黄豆粉3%(煮沸30min，4层纱布过滤取滤液，以下黄豆粉处理相同)、KH2PO40．05% 、MgSO40．05% 为基本培养基，调整碳源、氮源、无机盐和维生素进行单因素实验。如碳源单因素实验分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉为碳源;氮源则分别以蛋白胨、酵母膏、麸皮、黄豆粉、尿素、(NH4)2SO4、NaNO3为氮源;无机盐单因素实验分别将 KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、FeSO4作为无机盐;而维生素的因素实验分别将 VB1、VB2、VB6、VB1+VB2、VB1+VB6、VB2+VB6和 VB1+VB2+VB6作为生长因子。以获得培养双孢菇菌丝体最佳碳源、氮源、无机盐和维生素。

1．2．3．2 均匀设计实验 根据单因素实验结果选取最佳碳源、氮源、无机盐、生长因子，采用均匀设计表，每一因素取8水平。实验设计见表1。

1．2．4 发酵工艺参数的优化 在预实验的基础上，以接种量、发酵温度、转速为实验因子，以菌丝体干重作为指标，采用中心复合设计，各因子水平及编码表见表2。

表1 均匀设计实验因素及水平Table 1 Factors and levels of U8uniform design

表2 实验因素水平编码表Table 2 Factor and coded levels of experiment

1.3 数据分析

所有实验重复三次，单因素和均匀设计实验的数据用SPSS 16．0统计软件分析，组间多重比较用最小显著差异(Least Significant Difference，LSD)法;中心复合设计实验用Design Expert 8．0进行分析。

2 结果与分析

2.1 培养基优化实验结果

2．1．1 不同碳源对菌丝生长的影响 碳源浓度均为3%，碳源筛选实验的 F 值 =18．927 ＞ F0．01(=4．456)，说明不同碳源对菌丝体产量的作用差异是极显著的。LSD法进行多重比较，结果见表3。由表3可知可溶性淀粉作为碳源时，菌丝生长量最大，且和其它碳源作用的差异达极显著水平，麦芽糖、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇之间差异不显著。这是由于双孢菇为大型真菌，生长周期长，单糖、双糖代谢过快，不适应双孢菇的生长需要，而多糖类碳源需经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被利用，能提供长期营养，所以适合双孢菇的生长需要。

2．1．2 不同氮源对菌丝体生长的影响 氮源浓度均为 3%，对实验数据进行方差分析，F=119．037 ＞ F0．01(=4．46)，说明不同氮源对菌丝生长量有极显著差异影响。对数据进行多重比较(LSD法)，由表4可以得出:双孢菇对有机氮的利用明显好于无机氮，其中蛋白胨的菌丝体干重明显高于其他氮源，而酵母膏、麸皮和黄豆粉之间差异不显著，(NH4)2SO4、NaNO3和尿素上的菌丝体几乎不长，之间的差异也不显著。说明双孢菇本身不能直接利用无机氮合成某些氨基酸，需从有机氮源中摄取［12］。

2．1．3 不同无机盐对菌丝体生长的影响 所有无机盐加入量均为0．05%，无机盐筛选实验结果的F=6．997 ＞ F0．01(=5．064)，表明不同的无机盐会对菌丝体生长量产生极显著影响。采用LSD法进行多重比较(表 5)，可以看出:KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4对菌丝生物量的影响无显著差异，MgSO4与FeSO4、KCl之间存在显著差异，无机盐为FeSO4时菌丝体干重显著小于其他无机盐。下面实验中选用KCl。

表3 不同碳源对菌丝体干重影响差异显著性比较(LSD法)Table 3 Difference signification of carbon source effect on dry mycelia yield by LSD

表4 不同氮源对菌丝体干重影响差异显著性比较(LSD法)Table 4 Difference signification of nitrogen source effect on dry mycelia yield by LSD

表5 不同无机盐对菌丝体干重影响差异显著性比较(LSD法)Table 5 Difference signification of inorganic salt effect on dry mycelia yield by LSD

表6 不同维生素对菌丝体干重影响差异显著性比较(LSD法)Table 6 Difference signification of vitamin effect on dry mycelia yield by LSD

2．1．4 不同维生素对菌丝体生长的影响 维生素均加入10mg/100mL，计算实验结果的 F值 =6．031＞F0．01(=4．46)，即不同维生素对菌丝体生长影响差异达极显著水平，采用LSD法对数据进行多重比较(表6)，得出VB1对菌丝体生长最有利，它与其他维生素之间作用差异达显著水平，其他维生素之间无显著差异。

2．1．5 均匀设计实验结果与分析 对均匀设计实验结果(表7)利用SPSS软件进行回归处理，得出如下回归方程

式中 y 表示菌丝体干重(g/100mL)，x1、x2、x3、x4分别表示可溶性淀粉、蛋白胨、KCl、VB1的浓度。

R=0．995，R2=0．990，F=72．704 ＞ F0．01(4，3)=28．71，P=0．003，说明建立的回归方程具有显著的线性关系。对各因素的偏回归系数进行t检验(表8)，可以得知四个因素对菌丝体产量存在着显著影响，主次顺序为1/x1＞x2＞x4＞x3。

根据回归方程:菌丝体产量与可溶性淀粉的含量倒数呈负相关，与蛋白胨、VB1的浓度呈正相关，与KCl浓度呈负相关，所以，可溶性淀粉的浓度取实验浓度的上限即4．6%，蛋白胨取上限4．6%，KCl取下限0．02%，VB1取上限 18mg/100mL，将上述数据代入方程中，得出理论菌丝体干重为2．561g/100mL。

双孢菇的菌丝体产量与1/x1成一定的比例关系，如设A=x2/x1(即氮碳比)，上述线性方程可换算成:

这就直接证明了微生物生长量不仅与氮源、碳源含量有关，而且与它们的比值相关，在研究白灵菇深层发酵也发现了相同的规律［13］。

采用优化的培养基配方进行验证实验，所得菌丝体干重平均达2．602g/100mL，与预测值相符，优于均匀设计实验的所有组合实验值。

表7 均匀设计实验结果Table 7 Results of uniform design experiment

表8 各偏回归系数的显著性检验Table 8 Significance test of partial regression coefficients

2.2 中心复合设计实验结果与分析

2．2．1 回归模型的建立 运用 Design Expert 8．0对中心复合设计实验结果(表9)进行分析，得出的回归方程如下:

Y=3．052+0．085X1+0．168X2+0．086X3+0．047X1X2+0．036X1X3+0．137X2X3-0．132X12-0．351X22-0．146X32

其中 R2=0．960，F=26．56，p ＜0．0001，极显著;失拟性实验 F=1．02，p 值为 0．49，不显著，证明所建的回归方程拟合得很好。

2．2．2 各因子主次关系 方差分析结果(表10)表明:除X1X2，X1X3项外其余各项作用均达显著水平，根据回归方程中偏回归系数绝对值大小和F值，可以得到各因子和交互作用的主次顺序为:X22＞X2＞X32＞X2X3＞X12＞X3＞X1＞X1X2＞X1X3。

由于X1X2，X1X3项作用不显著，所以需将上述回归方程中这二项删除。

2．2．3 各因子组合的优化 根据已删除不显著项的回归方程，计算出 X1=0．32、X2=0．33、X3=0．45，将各因子的编码值换算成自然变量，即接种量11%、发酵温度26℃、转速 143r/min时，Y达最高值 3．113g/100mL。对优化的工艺进行验证，得出菌丝体干重达3．125g/100mL，说明得出的最佳工艺有很好的实用性。

2．2．4 响应面分析 图1为响应面分析图，从中可以直观看出各因子对响应值影响的变化趋势。图1A为当转速为143r/min时，随着接种量的加大和发酵温度的上升，菌丝体产量逐步提高，当达到一定水平时，产量不再上升，反而会下降;当发酵温度为26℃时，接种量和转速对菌丝体干重的影响如图1B所示，在接种量和转速在最优水平以下时，菌丝体干重随因子数值的增加而增加，到达最优水平以后，响应值下降。当接种量为11%时，发酵温度和转速对响应值的影响与以上分析相同(图1C)。

图1 双孢菇液体发酵工艺优化响应面分析Fig．1 Response surface analysis of optimization of liquid fermentation for Agaricus bisporus

3 结论

通过单因素实验筛选出双孢菇的最佳碳源、氮源、无机盐和维生素分别为可溶性淀粉、蛋白胨、KCl和VB1。通过均匀设计实验确定了双孢菇深层发酵的最佳培养基配方为:可溶性淀粉4．6%、蛋白胨4．6%、KCl 0．02%，VB118mg/100mL，理论预计值为2．561g/100mL，这一结论得到验证。中心复合设计实验的结果表明双孢菇溶层发酵的最佳工艺是:接种量11%、发酵温度26℃、转速143r/min时，此时菌丝体干重达3．112g/100mL。验证结果显示菌丝体干重达3．125g/100mL，与未优化的配方和工艺相比，产量提高了202%，说明得出的最佳工艺有很好的实用性。

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