海洋细菌Renibacterium sp.QD1产壳聚糖酶发酵培养基的统计优化

马靖峰，郭晓凤，刘 欢，邢培川，于文功，路新枝

(中国海洋大学医药学院，海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，山东青岛266003)

壳寡糖是由2～10个氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的低聚糖，主要由壳聚糖通过生物或物理化学方法降解获得。壳寡糖具有水溶性好、生物利用度高、生物活性多样等优点［1-2］，在众多领域具有重要的应用价值。在农业上，壳寡糖既可以作为新型农药防止病虫害［3］、又可以作为生物肥提高农副产品品质［4-5］;在医药领域，壳寡糖有抗肿瘤［6］、抗炎［7］、增强免疫［8］、调节肠道微生态［9］以及对阿尔茨海默病防治等作用［10］;在食品领域，壳寡糖是良好的食品增稠、稳定剂，此外还具有保鲜防腐功能［11］。随着壳寡糖生理功能的进一步发掘，市场的需求量将日益增大，开发高效、专一的新型壳聚糖酶制剂用于制备壳寡糖已成为一种趋势［12-14］。

海洋菌株Renibacterium sp.QD1是本实验室从海洋环境中筛选到的一株高产壳聚糖酶菌株，菌株QD1仅能产生一种胞外壳聚糖酶Csn-A，该酶具有活性高、pH适应范围广、酶解速率快等优点。邢培川等人对QD1的发酵条件进行了初步优化，确定了最适发酵温度，筛选了能影响酶产量的因素包括碳源、氮源、无机盐离子、pH、诱导剂［15］。本文在前期研究的基础上利用统计学方法包括Plackett-Burman实验、爬坡实验和响应面实验进一步对上述各因素进行系统优化，以期确定一种适合菌株Renibacterium sp.QD1大规模发酵产壳聚糖酶的培养基。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株:Renibacterium sp.QD1，由本实验室保存;3，5-二硝基水杨酸、琼脂糖、酵母粉、蛋白胨 购自青岛生工生物科技有限公司;壳聚糖粉末 购自桓台县金湖甲壳制品有限公司;氨基葡萄糖盐酸盐 购自Sigma公司;其它常规的试剂均为国产的分析纯试剂。

高速冷冻离心机J2-MC 美国BECKMAN COULTER公司;台式往复振荡培养箱TB-12R-3F 日本高崎(TAKASAKI)科学仪器公司;酶标分析仪 深圳雷杜生命科学学院股份有限公司。

1.2 培养基

种子培养基:壳聚糖5.00g/L、酵母粉0.50g/L、KH2PO41.00g/L、K2HPO44.00g/L、MgSO40.70g/L、NaCl 1.00g/L、初始 pH6.00。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养 挑取固体平板上单菌落接种于50mL尖底离心管中，尖底离心管装液量为5mL种子培养基，在28℃和转速170r/min条件下培养24h，再按1%(v/v)接种量转接至装液量为50mL的500mL锥形瓶，培养24h的菌液作为种子液。

1.3.2 摇瓶发酵培养 500mL锥形瓶装50mL发酵培养基，种子液以1%(v/v)的接种量接入灭菌后的发酵培养基中，在28℃和转速170r/min条件下培养40h。

1.4 粗酶液制备

发酵上清液，在 12000r/min、4℃条件下离心10min获得的上清液作为粗酶液。

1.5 酶活力的测定

参照文献［15］的方法。

1.6 实验设计

1.6.1 Plackett-Burman(PB)实验设计 根据前期邢培川等人的实验结果［15］，选择了能够影响Renibacterium sp.QD1发酵产壳聚糖酶的8个因素进行考察，以期筛选出能够显著影响壳聚糖酶产量的因素。实验中以壳聚糖酶活力单位作响应值，各实验组设三个平行，每个因素取高、低2个水平，实验次数n=12，实验设计见表1。

1.6.2 最陡爬坡实验 根据PB实验的结果确定影响酶产量的显著因素，以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，并根据效应值大小确定各显著性因素的步长，利用最陡爬坡实验以最快速度逼近壳聚糖酶产量的最大响应区［16］，并确定响应面分析的中心点。

1.6.3 中心组合实验设计(Central Composite Design，CCD) 根据最陡爬坡实验结果，利用 Design-Expert.V8.0.6软件设计 CentralCompositeDesign(CCD)实验，三个因素及其水平见表2。进行响应面分析，进而确定三个因素最佳水平，最后依据回归方程建立响应面立体分析图。

表1 Plackett-Burman Design设计中各因素水平安排Table 1 Range of different variables in the Plackett-Burman Design

表2 CCD设计中各因素水平安排Table 2 Level and code variables screened for CCD

1.6.4 验证实验 选择优化后的发酵培养基进行3次独立重复实验，取平均值，验证模型是否可靠，进一步确定最终优化结果。

1.7 数据统计

实验数据使用Design-Expert.V8.0.6软件自动进行处理并给出统计结果。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman(PB)实验设计及结果

通过PB实验对壳聚糖含量(A)、起始pH(B)、淀粉含量(C)、酵母粉含量(D)、K2HPO4含量(E)、KH2PO4含量(F)、MgSO4·7H2O 含量(G)、NaCl含量(H)，8个因素进行考察，以壳聚糖酶活力为响应值Y，实验设计及结果见表3，结果的方差分析见表4。

表3 Plackett-Burman Design设计及结果Table 3 Plackett-Burman experiment design and results

表4 Plackett-Burman Design对酶活的方差分析Table 4 ANOVA for Plackett-Burman Design on enzyme activity

2.2 最陡爬坡实验设计及结果

根据PB实验结果得出对产酶影响显著的3个因素是壳聚糖、酵母粉、pH，且均为正效应，因此选择浓度水平由低水平开始递增，根据各因子效应值及经验值确定三个因素的步长，实验设计及结果见表5。

表5 最陡爬坡实验设计及结果Table 5 Experimental results of the path of steepest ascent

由表5可知，在第3组实验条件下，壳聚糖酶活力最高，故以第3组培养条件作为响应面设计因素水平的中心点，即壳聚糖含量、酵母粉含量、pH分别为 11.00g/L、3.00g/L、6.50。

2.3 Central Composite Design实验结果及分析

表6 central composite design设计及结果Table 6 Experimental design and results of central composite design

表7 CCD实验对酶活的方差分析Table 7 ANOVA for CCD design on enzyme activity

2.4 响应面立体图

通过Design-Expert软件绘制了三维响应曲面图，各因素对酶活的影响可由模拟的响应面曲面图直观反映，其中酵母粉和pH交互作用显著，而酵母粉与壳聚糖、壳聚糖与pH交互作用不显著，如图1。

图1 两因素对酶活的响应面曲面图。Fig.1 Response surface plot for the effect of two various factors on chitosanase activity production

2.5 预测优化结果的实验验证

对Design Expert(version8.0)软件预测的结果进行实验验证，每组设3个平行，独立重复3次实验，结果见表8，实测值608.11U/mL与预测值626.46U/mL比较接近，较好的重现了预测结果，说明优化的结果是可靠的。

表8 优化结果的验证Table 8 Experimental verification of the theoretical optimum

3 结论

本文通过Plackett-Burman实验从8个因素中快速筛选出对Renibacterium sp.QD1发酵产壳聚糖酶显著影响的3个因素分别是壳聚糖、酵母粉、起始pH，以最陡爬坡实验逼近最大响应值区域，然后利用CCD实验对筛选出的3个显著性因子进一步优化，拟合了壳聚糖、酵母粉、起始pH，3个因素对壳聚糖酶酶活力的回归模型，由该模型预测的最优工艺条件为壳聚糖14.23g/L、酵母粉4.72g/L、起始pH6.42，以预测的最优培养基进行3次独立的重复实验，壳聚糖酶酶活力达到608.11U/mL，与预测值626.46U/mL比较接近，说明通过响应面优化Renibacterium sp.QD1发酵产壳聚糖酶是合理可靠的。至此，我们开发出一种适合大规模发酵的新型培养基:壳聚糖14.23g/L、淀粉3.00g/L、酵母粉 4.72g/L、KH2PO41.00g/L、K2HPO44.00g/L、MgSO40.70g/L，初始 pH6.42，优化结果与前期的实验结果400.00U/mL比较，经优化酶活力单位提高了52.03%。

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