膀胱出口部分梗阻中转化生长因子β1／Smads信号通路的激活及低剂量紫杉醇的干预作用

王 博，姜晓晓，彭云鹏，庄 岩，孙晓青，朱海涛

（徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏徐州 221002）

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是引发膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction，BOO）的常见原因，长期梗阻会引起进行性胶原沉积损害膀胱功能，目前其机制尚未完全明确。TGF－β1作为已知最强的致纤维化因子，主要通过经典的TGF－β／Smad通路方式介导信号的胞内传递。近年来发现TGF－β1在BOO 膀胱组织中表达增加，推测BOO 膀胱纤维化的进程中亦可能存在TGF－β1相关的Smads蛋白的表达。在多种器官纤维化模型的研究中，小剂量紫杉醇因被报道具有抗炎、抗纤维化的新型作用而受到较多关注。本文通过建立大鼠BOO 模型，探讨TGF－β1相关的Smads蛋白在大鼠BOO 膀胱中表达的变化以及小剂量紫杉醇对BOO膀胱的可能影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型建立 雌性SD 大鼠30 只，SPF级，体重180～200g，随机分为空白对照组（10只），BOO 组（10只）和紫杉醇组（10只）。BOO 组与紫杉醇组用20g／L 戊巴比妥钠（30 mg／kg）腹腔麻醉后固定，消毒。将直径1mm 硬膜外导管从尿道插入至膀胱，取下腹部正中切口，分离显露近端尿道，3－0丝线结扎尿道，结扎标准以导管移动无阻力且能略带动周围组织移动为宜。拔出导管，缝合下腹部切口。空白对照组在相同部位做相同手术操作，但不结扎尿道。在模型建立后，紫杉醇组给予紫杉醇（产品批号：130103，湖北威尔曼制药股份有限公司）溶于生理盐水（0.3mg／kg）后腹腔注射［1］，每周2次。空白对照组与BOO 组同时间等体积生理盐水腹腔注射。各组同条件饲养，自由饮食。4周后，称量体重后处死各组大鼠，取膀胱，去除周围脂肪与结缔组织吸净水分，称量膀胱重量。

1.2 HE染色 离体膀胱组织于4%中性甲醛中固定48h，进行酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡，包埋制成蜡块。连续切片，行HE 染色，光镜下观察膀胱肌层的增生情况。

1.3 Masson染色 石蜡切片脱蜡水化，苏木素10 min，流水冲洗5min，复合染液染色染5min，冲去染液，磷钼酸1min，冲去后滴加亮绿染液染色10s，水速洗，置于60℃温箱中烘干，封片。使用Image Pro Plus 6.0软件分析，每个标本随机取5个视野，以胶原纤维面积／（胶原纤维＋逼尿肌的面积）比值来反映纤维化的程度，取其平均值作为每例切片的结果。

1.4 透射电镜观察 膀胱离体后立即取1mm3体部组织，2.5%戊二醛（体积分数）中4℃固定，0.1mol／L磷酸盐缓冲液冲洗3遍，10g／L 锇酸溶液固定，双蒸水洗3遍，依次放入梯度乙醇、90% 无水丙酮（体积分数）脱水，树脂与丙酮混合液（V／V＝1／2）处理样品2h，树脂与丙酮混合液（V／V＝2／1）处理样品2h，纯树脂室温下浸透，然后进行包埋及聚合处理，LKBV2088超薄切片机制作超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双染色，H－600型透射电镜下观察、照相。镜下主要观察成纤维细胞及胶原纤维数量的改变。

1.5 免疫组织化学检测 采用SP 法。石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2（体积分数）以阻断内源性过氧化物酶活性，柠檬酸盐缓冲液（北京中杉，0.01mol／L pH 6.0）微波修复抗原，羊血清（北京中杉，SP－9001）封闭，一抗孵育，4℃过夜。使用生物素标记的二抗37℃孵育10min，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记链霉卵白素37℃孵育10 min，DAB（北京中杉，ZLI－9018）显色5min，苏木素复染，自来水反蓝，脱水封片。TGF－β1抗体（SANTA，sc－164）工作浓度为1∶400；p－Smad 2抗体（Bioworld，BS4172）工作浓度为1∶200；α－SMA 抗 体（Bioworld，BS70000）工作浓度为1∶200。以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗作为阴性对照。双盲状态下，利用Image－Pro Plus6.0图象分析软件，校正光密度值后对每个标本随机选5个视野进行平均吸光度分析，用阳性染色积分吸光度与肌组织面积的比值作为其平均光密度的值。

1.6 RT－PCR 检测取50 mg 冰冻膀 胱组织（－80℃），使用Trizol一步法提取膀胱组织总RNA，分光光度计测定浓度与纯度，用2.0μg的mRNA 作为逆转录模板，以20μL 反应体系进行逆转录，合成cDNA 后放于－20℃保存。然后进行PCR 扩增，总体系为25μL。cDNA 为反应的模板，GAPDH 为内参。GAPDH（264bp）：上游5－CCTTCATTGACCTCAACTACATG－3；下游5－CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC－3。TGF－β1（437bp）：上 游5′－CCGCAACAACGCAATCTA－3′；下 游5′－TGAGGAGCAGGAAGGGTC－3′。Smad 7（264bp）：上游5′－CTTCCTCCGATGAAACCG－3′；下 游5′－CGCCAT CCACTTCCCTTGT－3′。α－SMA（510bp）：上游5′－CTGAGCGTGGCTATTCCTTC－3′；下游5′－CGTCATACTCCTGTTTGCTGA－3′。

PCR 反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环，72℃再延伸10min。每个样本重复反应3次。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像系统照相，Image J软件分析结果。以目的基因条带与GAPDH 内参的灰度值的比值，作为目的基因mRNA 的相对含量。

1.7 统计学方法 计量数据结果以表示，采用单因素方差分析（One－way ANOVA），组间比较使用S－N－K 法，方差不齐时采用Dennett's方法作多重比较，相关性分析采用Pearson 相关分析。应用SPSS13.0 统计软件进行数据处理，检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠膀胱重量、膀胱重量与体重比的观察 各组大鼠体重无明显的差异（P＞0.05），而在膀胱重量方面，BOO 组明显高于空白对照组（P＞0.05），紫杉醇组低于BOO 组（P＞0.05）。BOO 组膀胱重量与体重比值高于空白对照组（P＞0.05），而紫杉醇组低于BOO 组（P＞0.05）。见表1。

2.2 超微结构改变 空白对照组肌细胞间隙狭窄，胞质见少量线粒体，形态完整。BOO 组中平滑肌肥大，细胞间隙增宽，大量胶原纤维沉积，可见部分类似细胞器碎片散落于间隙。成纤维细胞中线粒体数量增加，出现水肿，粗面内质网增多扩张。紫杉醇干预后平滑肌外形略减小，肌间隙减小，间隙中纤维较少沉积。

2.3 HE及Masson染色结果 空白对照组逼尿肌肌束排列整齐，胞质均匀、胞核清晰。BOO 组逼尿肌肌束肥大，排列紊乱，黏膜下层与肌束之间胶原纤维增多。紫杉醇组与BOO 组比肌增生较弱，数量略少，肌束间隙略大，胶原纤维显著减少。平均胶原纤维所占面积比值各组间存在显著差异。

2.4 超微结构改变 空白对照组肌细胞间隙狭窄，胞质见少量线粒体，形态完整。BOO 组中平滑肌肥大，细胞间隙增宽，大量胶原纤维沉积，可见部分类似细胞器碎片散落于间隙。成纤维细胞中线粒体数量增加，出现水肿，粗面内质网增多扩张。紫杉醇干预后平滑肌外形略减小，肌间隙减小，间隙中纤维较少沉积。

表1 大鼠体重、膀胱湿重、膀胱湿重与体重比及胶原纤维占面积百分比的比较 （）

表1 大鼠体重、膀胱湿重、膀胱湿重与体重比及胶原纤维占面积百分比的比较 （）

＊P＜0.05，与空白对照组比较；#P＜0.05，与BOO 组比较。

2.5 免疫组化结果 图像可见TGF－β1呈棕黄色主要在肌细胞胞质表达，p－Smad 2蛋白呈棕黄色在肌细胞胞核内表达，α－SMA 主要在平滑肌层表达。BOO 组和紫杉醇组TGF－β1、p－Smad 2和α－SMA的表达明显高于空白对照组（P＜0.05）；紫杉醇组明显低于BOO 组（P＜0.05）；空白对照组几乎无表达或少表达。见图1、表2。

图1 各组膀胱组织TGF－β1、p－Smad 2、α－SMA表达的变化（SP，×400）

表2 各组大鼠膀胱组织TGF－β1、p－Smad 2、α－SMA的平均光密度值的比较 （）

表2 各组大鼠膀胱组织TGF－β1、p－Smad 2、α－SMA的平均光密度值的比较 （）

＊P＜0.05，与空白对照组比较；#P＜0.05，与BOO 组比较。

2.5 RT－PCR mRNA 检测结果 BOO 组TGF－β1和α－SMA mRNA 表达明显高于空白对照组（P＜0.05）；紫杉醇组中TGF－β1 和α－SMA mRNA 表达低于BOO 组（P＜0.05），但Smad 7表达高于BOO组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠膀胱组织TGF－β1、Smad 7、α－SMA mRNA的相对表达情况比较 （）

表3 各组大鼠膀胱组织TGF－β1、Smad 7、α－SMA mRNA的相对表达情况比较 （）

＊P＜0.05，与空白对照组比较；#P＜0.05，与BOO 组比较。

2.6 相关性分析 BOO 组大鼠膀胱组织TGF－β1、p－Smad2蛋白表达与胶原纤维面积比成显著正相关（r＝0.892、0.794，P＞0.05）；α－SMA、p－Smad2蛋白的表达与TGF－β1呈显著正相关（r＝0.790、0.874，P＞0.05）。

3 讨论

BPH 是多发于中老年男性的排尿障碍性疾病，为BOO 常见原因之一。长期梗阻会引起膀胱结构的不可逆改变［2］，使得即便消除梗阻仍会有约30%患者难以恢复正常的膀胱功能。研究表明，BOO 后胶原纤维的沉积是损伤膀胱功能的主要因素［3］。因此对膀胱纤维化机制的研究是保护膀胱功能的重要方向。本实验中，梗阻后膀胱重量显著增加（P＞0.05），镜下可见肌细胞明显增生肥大，黏膜下与肌束间胶原纤维明显增多沉积，这些现象同KITAJIMA［4］等在羊BOO模型中的研究结果相符。

在各系统纤维化的研究中，TGF－β1被认为是最强的致纤维化因子［5］。有报道指出在BOO 早期，TGF－β1 就已经 参与了 膀胱形 态的变 化［6］。DE ALMEIDA PRADO PS等［7］用阿米替林加重BOO大鼠膀胱纤维化程度后，逼尿肌中TGF－β1的表达水平显著增加，可见TGF－β1在膀胱纤维化的进程中也有着重要作用，但是TGF－β1激活后，其胞内信号传递机制尚不完全清楚。

目前认为Smads蛋白是介导TGF－β1信号胞内传导的主要中间蛋白，与TGF－β1促进纤维化作用密切相关［8］。近期在炎性膀胱的研究中ISLAM等［9］发现，TGF－β1可依赖Smad2／3方式介导膀胱上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程，促进纤维细胞合成胶原纤维以利于损伤区修复。推测在膀胱纤维化进程中可能同样存在Smads蛋白的表达。本研究中，相比空白对照组，BOO 膀胱中TGF－β1、p－Smad 2和α－SMA 蛋白表达显著增加（P＞0.05），相关分析显示p－Smad 2与TGF－β1和纤维面积比值均呈显著正相关（P＞0.05），提示TGF－β1的增加可促进胞内信号蛋白Smad 2的激活，刺激成纤维细胞胶原的合成，加速纤维化进程。此结果同时也提示对TGF－β1／Smad 信号通路的干预很可能有延缓BOO 膀胱纤维化的作用。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）作为抗肿瘤药物以其高效低毒的优点在临床上长期使用，近期研究发现紫杉醇除在治疗剂量下调控细胞分裂增殖外，当小剂量低频率使用时，其还具有能够安全有效的抑制纤维增生的作用［10］。

动物研究发现损伤组织中局部涂抹紫杉醇（0.4～1.0mg／mL）能减少成纤维及炎细胞数量，有抑制瘢痕形成的效果［11］。有学者在肺纤维化模型中使用紫杉醇后，发现小剂量紫杉醇能降低TGF－β1 的表达，减轻上皮间质转化程度［12］。在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）的研究方面，腹腔注射低剂量紫杉醇（0.3mg／kg，每周两次）能调控TGF－β1表达，抑制Smad 2／3磷酸化，减少胶原生成。在多学科中已有低剂量紫杉醇抑制胶原沉积的报道，但其在BOO 后膀胱纤维化中的作用还未见研究。

在本实验中，低剂量紫杉醇干预后膀胱组织纤维增生减弱，TGF－β1、Smad 2、α－SMA 表达减少，抑制型Smad 7表达升高，进一步提示了TGF－β1／Smads信号通路可能为导致膀胱胶原沉积机制之一。低剂量紫杉醇可通过部分下调TGF－β1／Smads通路蛋白表达起到延缓膀胱纤维化进程的作用。另外，由于TGF－β1／Smads通路的激活本身还受到多种细胞因子影响以及该药物的剂量效应关系尚不明了，具体的分子机制及药物反应作用仍需进一步的探索研究获得。

［1］ZHANG D，SUN L.Low－dose paclitaxel ameliorates renal fibrosis in rat UUO model by inhibition of TGF－β／Smad activity［J］.Lab Invest，2010，90（3）：436－447.

［2］METCALFE PD，WANG J，JIAO H.Bladder outlet obstruction：progression from inflammation to fibrosis［J］.BJU Int，2010，106（11）：1686－1694.

［3］YANG L，LIU R，WANG X，et al.Imbalance between matrix metalloproteinase－1（MMP－1）and tissue inhibitor of metalloproteinase－1（TIMP－1）contributes to bladder compliance changes in rabbits with partial bladder outlet obstruction（PBOO）［J］.BJU Int，2013，112（4）：E391－E397.

［4］KITAJIMA K，AOBA T，PRINGLE K C，et al.Bladder development following bladder outlet obstruction in fetal lambs：optimal timing of fetal therapy［J］.J Pediatr Surg，2010，45（12）：2423－2430.

［5］POHLERS D，BRENMOEHL J，LOFFLER I，et al.TGF－βand fibrosis in different organs－molecular pathway imprints［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1792（8）：746－756.

［6］SONG YS，LEE HJ，DOO SW，et al.Enhanced angiogenesis and relaxation of bladder as early response to bladder outlet obstruction［J］.Int J Urol，2013，20（1）：116－122.

［7］DE ALMEIDA PRADO PS，SOARES MF，LIMA FO，et al.Amitriptyline aggravates the fibrosis process in a rat model of infravesical obstruction［J］.Int J Exp Pathol，2012，93（3）：218－224.

［8］LEASK A，ABRAHAM D J.TGF－βsignaling and the fibrotic response［J］.FASEB J，2004，18（7）：816－827.

［9］ISLAM S S，MOKHTARI R B，El HOUT Y，et al.TGF－β1induces EMT reprogramming of porcine bladder urothelial cells into collagen producing fibroblasts－like cells in a Smad2／Smad3－dependent manner［J］.J Cell Commun Signal，2013.

［10］SANDBO N，NGAM C，TORR E，et al.Control of Myofibroblast Differentiation by Microtubule Dynamics through a Regulated Localization of mDia2［J］.J Biol Chem，2013，288（22）：15466－15473.

［11］王利换，张杰，陈楠，等.局部应用紫杉醇抑制兔气管损伤后瘢痕组织形成的初步研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2013，36（3）：202－206.

［12］WANG C，SONG X，LI Y，et al.Low－dose paclitaxel ameliorates pulmonary fibrosis by suppressing TGF－β1／Smad3pathway via miR－140 Upregulation［J］.PLOS One，2013，8（8）：e70725.