肾透明细胞癌淋巴管新生与临床病理因素的关系

陈志华，王勤章，丁国富，钱 彪，李 强，倪 钊

（石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆石河子 832000）

肾透明细胞癌是肾脏最常见的恶性肿瘤，约10%～25%的患者可能会发生肾门和局部淋巴结转移，淋巴结出现转移表明患者的预后不良［1］。多年来由于缺乏淋巴管内皮细胞的特异标记物，对于淋巴管的研究相对较少，也未引起足够的重视。近年来，由于D2－40能特异地标记淋巴管而被学者作为一免疫组织化学物应用于标记肿瘤淋巴管新生［2］。目前肾透明细胞癌淋巴管新生对患者预后的影响还不清楚，本研究旨在利用D2－40来标记淋巴管，探讨肾透明细胞癌淋巴管新生与临床病理因素的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象是在石河子大学第一附属医院病理科收集的2005～2012年被诊断为肾透明细胞癌的60例患者的石蜡块。纳入标准：调阅蜡块的HE切片包含癌组织和正常肾组织。26 例女性，34例男性，患者年龄35～71 岁，平均（58.21±11.34）岁。所有患者均行根治性肾切除术或肾部分切除术，其中15例患者因怀疑淋巴结转移，术中行淋巴结清扫，其余45例患者没有行淋巴结清扫。临床病理因素包括远处转移、淋巴结转移、T 分期及Furman细胞核分级从患者病例资料和术后病理检查结果获得。

1.2 染色方法 采用SP 法进行免疫组织化学染色，单克隆抗体D2－40（ZM－0465）和二抗试剂盒均购至北京中衫金桥生物技术有限公司。将石蜡块4μm连续切片，二甲苯脱蜡，乙醇水化。用3% 的过氧化氢浸泡10min来阻断内源性过氧化物酶活性，然后将玻片放入0.01mol／L、pH6.0的柠檬酸缓冲液中，置入高压锅中加热至喷气后开始计时，8min后停止加热以充分暴露抗原。滴加鼠抗人D2－40抗体，4℃孵育过夜，加入第二抗体，37℃恒温箱反应30 min。随后用二胺基联苯胺四盐酸盐在显微镜下观察显色，显色时间依观察结果灵活掌握调控。再经苏木精对比染色，脱水、透明、封片。以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性结果作阳性对照。处理完成后用光学显微镜来观察。

1.3 结果判定 所有的标本均由两位有经验的病理科医师进行双盲法阅片。免疫组化切片中见D2－40标记的条索状、管腔样结构的细胞胞质或胞膜内出现棕黄色标记物为阳性，一个管腔切面或一条条索状物计数为一条新生淋巴管。肿瘤组织外500μm 区域被认为是癌周组织区域。首先在10×10倍镜视野确定每张组织切片内阳性染色脉管最丰富区，再在10×20倍视野下随机取3个视野计数淋巴管数目，统计每个视野中的淋巴管数目，然后取3个视野平均值作为癌周淋巴管密度。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0版软件进行统计分析。淋巴管新生与临床病理因素的相关性，用χ2检验或Fisher's确切概率法进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

60例研究对象均为肾透明细胞癌。按Fuhrman细胞核分级标准进行分级，其中Ⅰ级4 例，Ⅱ级38例，Ⅲ级17例，Ⅳ级1例。按2011年的肾肿瘤TNM分期标准进行分期，36例 为pT1，7 例 为pT2，15 例为pT3，2例为pT4。6例发生远处转移，行淋巴结清扫的患者有5例出现淋巴结转移。

2.1 D2－40在肾透明细胞癌中的表达情况 通过显微镜观察发现癌旁正常肾组织内在血管周围有少量的淋巴管；癌周区淋巴管丰富，扩张与闭锁的淋巴管共存，以扩张的淋巴管为主；在癌内区，淋巴管的数量明显减少甚至缺如，故仅观察癌内是否有淋巴管出现（图1）。

图1 D2－40在肾透明细胞癌组织（DAB，×200）

2.2 D2－40在肾透明细胞癌中的表达与临床病理因素的关系 所有研究对象均观察到丰富的癌周淋巴管（peritumoral lymphatic vessels，PLVs），13例观察到有癌内淋巴管（intratumoral lymphatic vessels，ILVs）出现。平均的癌周淋巴管密度（peritumoral lymphatic vessels density，PLVD）是16.89，29例患者的PLVD≥16.89，31例患者的PLVD＜16.89，两组在远处转移、淋巴结转移、Fuhrman细胞核分级及肿瘤T 分期间的比较结果均无统计学意义（P＞0.05，表1）。

按癌内是否有淋巴管出现分为阳性表达组（ILV－positive）和阴性表达组（ILV－negative），两组间在远处转移，淋巴结转移，Fuhrman细胞核分级的比较结果有统计学意义（P＜0.05），对于肿瘤T 分期则无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表1 PLVD与临床病理因素间的相关性 （例）

表2 ILVs的出现与临床病理因素间的相关性

3 讨论

肾透明细胞癌是肾脏最常见的癌症，有很多的临床病理因素对患者的预后有影响，包括远处转移、淋巴结转移、肿瘤分期、Fuhrman细胞核分级及血管侵犯等。目前已有大量的学者在进行肾肿瘤血管方面的研究，对于淋巴管方面的研究相对较少，这一现状直到淋巴内皮细胞D2－40的出现才得到改善。D2－40分子是MARKS等［3］于1999年在研究生殖细胞肿瘤和胚胎睾丸的精母细胞表面时新发现的一种唾液酸黏蛋白。SAAD等［4］的研究发现D2－40能特异性地标记淋巴管内皮细胞，而不标记毛细血管，更不标记血管内皮，被视为最佳的淋巴管标记物，被越来越多应用于区别血管和淋巴管。一些研究已经在利用D2－40采用免疫组织化学的方法来评价淋巴管新生与临床病理因素之间的关系。

在我们的研究中，60例肾透明细胞癌患者的标本均发现有丰富的PLV，平均PLVD 为16.89，我们经统计学分析发现PLVD 与临床病理因素均无相关性，表明癌周淋巴管新生对患者的预后可能无影响。这一结果与IWATA T等［5］的研究相似，他们发现在肾细胞癌中，癌周淋巴管数与临床病理因素无明显的相关性，认为癌周淋巴管对于肿瘤的进展起次要的作用。ISHIKAWA等［6］的研究 通过应 用D2－40 进 行免疫组化染色能清楚显示正常和病理状态下肾组织的淋巴管分布，他们的研究结果也表明肾细胞癌PLV 的数量较正常的肾皮质明显的增加，但没有发现PLVD 与淋巴结转移有相关性，BALDEWIJNS等［7］的研究则表明癌周淋巴管新生与肿瘤TNM 分期及Fuhrman细胞核分级无关系，认为癌周与正常的肾组织淋巴管数量无差异。而丁贵坡等［8］发现在乳腺癌中PLVD 与肿瘤的大小、临床分期及淋巴结转移状态相关。ZENG等［9］发现在前列腺癌中，癌周淋巴管密度和癌周淋巴管侵犯与肿瘤淋巴管转移有显著的相关性。间接表明癌周淋巴管新生对患者的预后有不良影响，与我们的结果相悖。本研究仅有13例患者的标本发现ILV，淋巴管数较少，大部分呈长条形或塌陷状态，考虑为癌组织间高压所致。统计学分析表明远处转移、淋巴管转移及Fuhrman细胞核分级均与ILV 的出现有显著的相关性。ILYAS等［10］的研究结果与我们相似，他们同样没有发现PLVD与临床病理因素有相关性，ILVs与远处转移和淋巴管转移有显著相关性。PAWEL DE BIńSKI等［11］也发现癌内淋巴管的出现与临床病理因素有显著相关性。远处转移和淋巴管转移及Fuhrman细胞核分级已被证实与肿瘤患者预后密切相关，说明癌内淋巴管新生在肿瘤的进展中起重要的作用，故我们有理由相信癌内淋巴管新生对患者的预后可能有不良影响。至于癌内淋巴管新生如何对患者的预后造成影响，其原因尚不明确。相关研究提示多种恶性肿瘤组织中存在新生淋巴管，但癌细胞是通过已有的淋巴管还是新生的淋巴管转移存在很大争议［12］。传统观点认为肿瘤的淋巴道转移是一个被动过程，肿瘤细胞通过已有的局部淋巴管转移到区域淋巴结，其中淋巴管内皮细胞只是起到被动作用。在本研究中，仅少数患者有ILV 出现且与淋巴结转移密切相关（P＝0.017），故我们考虑癌内新生的淋巴管可能促进了淋巴结的转移。具体的机制还需要大量相关研究来探讨。

综上所述，我们认为癌内淋巴管新生可能对肾透明细胞癌患者的预后有不良影响，可以作为判断患者术后预后不良的因素，对术后患者预后的预测及辅助治疗扩展思路，提供临床应用价值。但还需要大样本研究来进一步证实，因为这一类的相关研究较少，且他们的研究结果往往相矛盾。下一步我们将对患者预后资料进行收集和分析来进一步论证肾透明细胞癌淋巴管新生对患者预后的影响。

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