诱导多能干细胞在眼科治疗的应用前景及其进展

孙蓓 张东蕾 王卓实 何伟

2006年，日本Yamanaka研究小组[1]将逆转录病毒介导的Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个外源基因转入小鼠成纤维细胞中，使成体细胞重新编程为具有多向分化潜能的干细胞，并称为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）[1-3]。随后，2007年，日本及美国的实验室分别又利用转基因技术将人的成纤维细胞重新编程为iPSC[4]。近年来，iPSC诱导技术研究取得了快速的进展，目前，除了利用病毒[4-6]、质粒或转座子[7-9]等作为载体携带外源基因将人或鼠的成体细胞重新编程为iPSC，还有实验室利用重组蛋白技术，小分子化合物及microRNAs等方法[10-12]获得iPSCs。到目前为止，除成纤维细胞[1-3]以外，已有多种类型成体细胞被重编程为iPSCs，如神经干细胞[13]、胰腺β细胞[14]、角质形成细胞[15]、黑色素细胞[16]、血细胞[17-18]、脂肪干细胞[19-20]及尿液细胞[21]等。由体细胞诱导的iPSCs无论是在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力，还是在分化能力等方面都与胚胎干细胞极为相似。此外，iPSCs可诱导分化成一系列特定类型的细胞，如胰岛素分泌细胞[22]、神经细胞[23-25]、肝细胞[26-27]、肌细胞[28-29]、心肌细胞[30-31]、视网膜神经节细胞及感光细胞[32]等。iPSCs技术的建立被认为是干细胞研究领域的一个重大发现和突破，由于iPSCs可来源于患者自身的体细胞，因此既可以回避干细胞治疗涉及到的有关伦理道德问题，又避免了异体免疫排斥反应，使得干细胞个体化治疗成为可能，其临床应用前景备受关注。本综述将着重从诱导多能干细胞iPSCs的重编程方法，iPSCs定向诱导分化成视网膜细胞的方法，及其在眼科治疗的应用前景和进展做一阐述。

一、重编程方法

目前认为，影响产生可供临床使用及安全可靠的iPSc主要因素有以下两个：重编程方法以及被重编程细胞的来源。自2007年Thomson实验室[4]以及Yamanaka研究小组[1]首次编程成功人iPSCs以来，已有超过100项关于人iPSCs重编程方法的研究报道[33]。概括起来，现应用的重编程方法大概有以下几类：整合载体、可删除型整合载体、非整合载体以及非转基因转运方法等。

（一）整合载体

有很多类型的整合型病毒载体被用在iPSCs的重编程过程中，其主要包括：逆转录病毒载体、慢病毒载体以及腺病毒载体。

1.逆转录病毒载体：逆转录病毒载体由于其被大家熟知的生物学特性及较高的转染效率而被广泛的应用于临床基因治疗和基础研究中。逆转录病毒是建立iPSCs过程中首个被应用的载体，并且病毒的整合位点已被研究者深入而全面的研究。Yamanaka研究小组通过逆转录病毒将Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个重编程因子转染至鼠尾成纤维细胞产生iPSCs，在这项研究中所使用的载体是以MMLV为基础的逆转录病毒载体，这种载体在干细胞中有自我沉默的特性，免除了对外源因子的定时撤出，但转染效率低[1-3]。此外，Daley研究小组通过以MSCV为基础的逆转录病毒转染Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个因子并联合hTERT及SV40LT抗原成功重编程皮肤成纤维细胞为iPSCs，但是此法仍然转染效率不高[34]。为了改善转染效率，很多重编程方案被提出，包括Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四因子及其他因子或者小分子的联合应用。逆转录病毒介导的基因转运方法的重编程效率部分的依赖于成体细胞的类型。近年研究发现，在逆转录病毒载体介导的iPSCs重编程过程中，上皮细胞源性的iPSCs重编程比MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)源性的iPSCs重编程过程要容易很多[15]。逆转录病毒有整合附近起始位点的倾向及易导致恶性转化的结果，所以在未来临床应用方面的价值还值得商榷。

2.慢病毒载体：慢病毒属于逆转录病毒的子集，能够感染分裂期细胞及非分裂期细胞，并能整合进基因组。此外，慢病毒同逆转录病毒相比的另一个的优势是，它能转录大片段的基因组。近期有实验者将重编程的Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个因子转运至多顺反子慢病毒的单一构造中，代替了先前四个各携带一个基因的相互分离的载体，实验结果显示，来自于单个载体整合的iPSCs不仅能将因插入外源基因而产生的突变最小化，而且能提高转染效率[35-36]。但是慢病毒重编程方法有一个潜在的缺陷，当iPSCs分化成各种类型细胞时，重编程的因子会经常被再次激活，进而导致肿瘤的形成。

（二）可删除的整合载体

作为下一步更具安全性的改进方案，可删除性的整合载体被设计出来，目的是为了产生非转基因的iPSCs及避免整合载体带来的潜在性致瘤作用。

1.病毒源性可删除载体：Jaenish研究小组近期设计出包含有可用最小限度强力霉素诱导表达的CMV启动子及一个在3’LTR的loxP位点的慢病毒载体。使用这个系统，重编程因子能够在细胞Cre重组酶的表达下被切割移除。另外，Jaenish的研究资料表明，非转基因iPSCs能够维持潜能性阶段，并且全基因的表达谱数据同ES细胞很接近[37]。但是这个研究的主要缺陷是会导致基因重排及基因组的不稳定。为了克服这一缺点，Townes的研究小组使用了多顺反子的慢病毒载体进行iPSCs的重编程，但是所产生的iPSCs依然含有插入位点，因此从遗传学角度来看依旧不能称之为完全的多潜能性干细胞[38]。

2.转座子源性的可删除载体：转座子（transposon）是一个非固定的基因单位，可以在单个细胞的基因组中从一个位点转移至不同的位点，能够导致基因的重排及突变。Kaji及其合作者利用piggyback(PB)系统高效的将成纤维细胞重编程为iPSCs，这些iPSCs中瞬时表达的转座酶可切除引入的外源基因，但不引起细胞基因组DNA序列的变化[39]。另外一个转座子系统是Sleeping Beauty(SB)系统，Dinnyes小组利用该系统使用Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个因子分别将ICR远交群小鼠、C57BL/6-近交群小鼠以及C57BL/6 x DBA/2J产生的小鼠这三类不同基因背景小鼠的成纤维细胞成功编程为iPSCs[40]。其产生iPSCs的效率同PB系统类似，但是整合和删除过程同PB系统相比并不完全可靠[41]。

（三）非整合载体

为了避免在重编程过程中宿主细胞基因组被干扰，安全性更高的重编程方案被进一步提出。

1.病毒型非整合载体：Stadtfeld利用腺病毒载体转染Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个因子至成体肝细胞，将其重编程为非整合的iPSCs，但是转染效率很低，只有0.0006﹪[42]。而最近Zhou的研究小组利用腺病毒转染Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个因子至人的成纤维细胞，产生iPSCs的效率依旧非常低[43]。大量的实验结果表明，腺病毒不太具有转运多个因子至同一个细胞的能力，且整合进细胞基因组中的可能性较小，可于供体细胞中瞬时表达转录因子，易于获得无毒害副作用的或无病毒载体整合的iPSCs，但重编程iPSCs的效率较逆转录病毒和慢病毒方法低许多，需要对细胞进行反复转染。

2.质粒载体：Yamanaka研究小组通过在第1、3、5、7天瞬时转染环状质粒表达的因子至MEF细胞而得到了iPSCs。建立起的诱导多能干细胞系在细胞形态学同ES细胞极其相似，并且在ES细胞潜能性标记物的表达上保持相似的水平。另外，这些细胞不含有载体并且非整合[44]。Gonzalez的研究小组通过反复瞬时转染一个编码有Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四个因子的单独的多顺反子载体将MEF细胞重新编程为iPSCs，实验结果显示这些细胞不含有转入基因的整合[45]。但是通过质粒转染进行重编程的效率被认为低于逆转录病毒及慢病毒的转染效率。

3.附着体瞬时转染：附着体载体，例如以EBNA1为基础的附着体载体，能够在分裂期及非分裂期细胞中作为染色体外元件自发的自我复制且不整合于基因组中。因为在目的细胞中重编程因子的持续增强表达，使其同传统的质粒载体相比更具有优越性。Yu的研究小组利用三个独立的oriP/EBNA1附着体载体，将Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nango,Lin28及SV40LT七个因子用不同的组合形式放置于CMV和EF1启动子的下游，成功将人包皮成纤维细胞转染成iPSCs[46]。另外，Chou的研究小组使用了编码有Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Lin28五种因子的单独的多顺反子oriP/EBNA1附着体载体系统成功将人外周血细胞重编程为iPSCs，并且转染效率同其他附着体载体相比提高了10～100倍[47]。近期Meng等[48]利用oriP/EBNA1附着体载体，仅使用Oct3/4，Sox2两种因子及SFFV启动子，使2﹪的脐带血CD34+细胞成功转化为iPSCs。并且研究者注意到重编程的效率同Oct3/4，Sox2两种因子的表达密切相关，因此Meng等[48]设计了一个含有Wpre元件的附着体载体，使用这个改良后的载体，转基因的表达率增加了50﹪，仅使用Oct3/4，Sox2两种因子高效的产生了无转基因的iPSCs。随后该研究小组利用oriP/EBNA1 附着体载体，使用 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc及BCL-XL五个因子成功将成人外周血细胞重编程为iPSCs，并且重编程效率也有明显提高[49]。而此项研究结果为诱导多能干细胞库，疾病模型及再生医学提供潜在的应用。

（四）非转基因转运方法

为避免因基因插入带来的突变或致瘤性，非转基因重编程成体细胞的方法被提出。

1.重组蛋白质转运：这个以重组蛋白为基础的方法能够避免因整合外源DNA而引起的插入突变。Zhou等[10]纯化了重编程因子翻译的重组蛋白，再将其与细胞穿膜肽形成融合蛋白，穿透细胞膜而进入细胞内部，在丙戊酸(Valproic acid，VPA)的配合作用下获得了小鼠胚胎成纤维细胞转化的iPSCs，人的成纤维细胞也通过类似的方法(没有使用VPA)获得了iPSCs。但是重编程的持续时间较长且效率偏低，重编程效率不到0.001﹪。

2.小分子转运法：邓宏魁的研究小组利用FSK、VPA、CHIR、616452、Tranyl、DZNep、TTNPB等七种小分子组合，成功将小鼠MEF细胞重编程为iPSCs。所获得的iPSCs在倍增时间及潜能性标记物的表达上同ES细胞非常相似。实验结果提示，可通过小分子非特异性调节细胞内分子信号通路，代替主控基因进行细胞的重编程。但是小分子的方式重编程效率仍旧不高[50]。

3.microRNAs(miRNAs)：近年的研究发现，几个microRNAs(miRNAs)的单独表达连同OSKM四因子协同作用于细胞的重编程过程中时，能够增强细胞的重编程效率[51]。这些miRNAs属于优先表达在胚胎干细胞的miRNAs家族，被认为能够帮助维持ES细胞的表型。Morrisey的研究小组近期发现，miR302/367簇能够更快速及有效的重编程鼠及人的成体细胞，并且这一过程不需要任何外源性的转录因子的加入。miR302/367簇由五个miRNAs组成，其中四个是miR302a/b/c/d，含有同一个种子序列。研究发现miR302/367簇的表达水平同Oct3/4在ES细胞的转录及早期胚胎发育相关，这提示其在ES细胞的稳态和干性的维持的重要作用。此项研究提出了一个非病毒，无转录因子介导的产生iPSCs的新方法，这不仅可以用于干细胞生物的基础研究，并且能够用于患者来源的高效率iPSCs产生的临床研究[52]。

二、iPS细胞重编程过程中成体细胞的来源

理论上，各种类型的成体细胞都有可能被重新编程为iPSCs。目前，已有许多类型成体细胞可以被重新编程为iPSCs，如人和鼠的成纤维细胞、神经干细胞、胰腺β细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、血细胞脂肪干细胞及尿液细胞等。但是要选择一种提取过程简单、编程时间短以及诱导效率高的体细胞，以便可以更好的研究iPSCs。当前发表的文章中研究最多的是成纤维细胞，这种细胞最大的优点就是容易在体外进行培养，但是缺点是从患者身体获得细胞时需要组织活检或者外科手术的形式，诸如麻醉、切口、缝合，这些不仅不方便，而且有痛苦同时还会带来潜在性的并发症，包括感染等。除此之外，它获得iPSCs的效率也比较低[53]。神经干细胞用来产生iPSCs是一种较好的且编程较简单的备选细胞，并且可以作为iPSCs的移植、药物研发和人类疾病机制研究的理想模型，它被重新编程为iPSCs仅需要一种或两种因子诱导[13]，但是获得神经干细胞比较复杂，并不能作为稳定的细胞资源。角质形成细胞因其高表达内源性c-Myc基因，所以用于产生iPSCs时很容易获得，虽然与成纤维细胞相比，重新编程的效率提高了一百倍，速率提高了两倍[15]，但其在体外培养时间较长。脐带血细胞可重新编程为iPSCs，且仅用两种因子Oct3/4和Sox2[18]。Amanda研究小组使用改良后的oriP/EBNA1附着体载体，使2﹪的脐带血CD34+细胞成功转化为iPSCs，大大提高了重编程效率，主要原因归功于改良后附着体载体的设计优势，这种改良后的附着体含有SFFV启动子以及Wpre元件。SFFV启动子在造血细胞中可以驱使转基因有更高水平的表达；Wpre元件是一个转录后调节元件，一般用于慢病毒载体以改进转基因的表达。在此研究结果中，Wpre元件使得转基因表达增加了50﹪，据此提高了细胞的重编程效率[48]。此外外周血中获得的CD34+细胞也可以编程为iPSCs，Amanda等利用oriP/EBNA1附着体载体，使用 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc及 BCL-XL五个因子成功将成人外周血细胞重编程为iPSCs，且同之前的重编外周血的CD34+细胞诱导效率相比明显提高，主要原因有两个：（1）实验者使用了改良的附着体载体，这种载体使用了SFFV启动子；（2）在重编程过程中加入BCL-XL，使之与Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc四个因子联合应用。BCL-XL有抗凋亡的作用，可以使细胞的生存率增加，导致重编程因子的异常表达。并且BCL-XL的过表达会导致黏附分子表达的上调，促进细胞与基质间的黏附，进而提高细胞重编程效率[49]。Utikal首次将黑色素细胞重新编程为iPSCs，由于它可以高表达内源性的Sox2，所以用Oct3/4、c-Myc和Klf4可将黑色素细胞重新编程为iPSCs[16]，并且其转染效率高可达到0.05﹪，转染速度更快，只有10d左右。脂肪干细胞可在无饲养层的条件下重新编程为iPSCs，它较易获得且数量较多，脂肪干细胞是异质性多能祖系细胞，可以分化为多种细胞系，包括骨、软骨、肌肉和脂肪组织[19-20]。胰腺β细胞可编程为iPSCs，这为一些糖尿病患者提供了新的治疗方法，而且产生患者特异性的iPSCs，特异性的iPSCs可定向分化为分泌胰岛素细胞，再将这些细胞移植回患者体内，不仅避免了免疫排斥反应，还解决了供体资源短缺的问题[14]。最近，裴端卿及其研究小组通过构建一个表达miR302/367簇的附着体载体并同时转染了 Oct3/4、Sox2、Klf4、SV40T四个因子，成功将尿液细胞重编程为iPSCs，结果显示，尿液细胞比成纤维细胞更容易被重编程[21]。这项研究结果为未来更深一步的临床应用提供了理论依据。首先，裴端卿研究小组尿液细胞重编程的过程中在无饲养层细胞，无病毒，没有c-Myc因子的条件下产生iPSCs，为进一步的临床应用打下基础；其次，尿液来源的细胞取材完全没有侵入性，尤其适合儿童及一些特殊疾病的患者，比如血友病；最后，尿液细胞显示上皮细胞的表型，通过绕过间叶细胞向上皮细胞转化这一过程，比皮肤间充质成纤维细胞更容易被重编程为iPSCs。从以上重编程的体细胞的细胞来源来看，血细胞取材方便，来源较稳定；尿液细胞取材没有侵入性，方便获得，因此受到研究者越来越多的关注。

不同来源的细胞在重编程为iPSCs时都有自身的有利性及局限性。表1对目前不同重编程方法及被重编程的体细胞做了一个概括性的总结。近期的研究显示iPSCs在细胞特性和分化潜能上，显示出显著的基因影响及表观性记忆，而这些都依赖于来源体细胞的类型[54]。如果这一结果被更

多的研究进一步的证实，那么未来针对患者特异iPSCs产生所需的最佳细胞来源的选择，则需要更为慎重的考虑。

表1 不同诱导多能干细胞的重编程方法比较

三、iPSCs分化成视网膜细胞

iPSCs有自发向视网膜上皮细胞（RPE）分化的倾向。2009年，DENNIS O.CLEGG研究小组利用Oct3/4、Sox2、Nanog以及Lin28四个因子重编程成纤维细胞，得到了iPSCs后经过自发分化成为RPE细胞，尽管通过自分化后的RPE细胞在第4～5代后其色素上皮的表型会逐步减弱，但是在前两代的RPE细胞和经由胚胎干细胞分化的RPE细胞以及人类胎儿的RPE细胞在形态学、基因及蛋白表达，杆外节吞噬作用上都及其相似，这说明iPSCs能自分化成为有功能性的RPE细胞[55]。同年，Masayo Takahashi小组使用酪蛋白激酶1抑制剂CKI-7、ALK4抑制剂SB-431542，以及Rho相关激酶抑制剂Y-27632等小分子在无血清无饲养层的悬浮培养条件下将hiPSCs诱导分化为RPE及感光细胞[39]。并且为了建立分化细胞最终成品的未分化残余hiPSCs的高灵敏度测定，2012年，Masayo Takahashi小组使用传代后第三代及第四代的纯化hiPSCs-RPE进行了三个体外检测：软琼脂克隆形成实验，流式分析以及qRT-PCR。实验结果显示，使用Lin28作为目标基因的qRT-PCR能够成功检测出hiPSCs-RPE中0.002﹪的hiPSCs残余[56]，这为未来临床应用的安全监察提供了一个有效手段。

在体外实验方面，Amanda-Jayne Carr研究小组将hiPSCs-RPE的细胞悬液通过视网膜下途径移植至RCS大鼠体内，结果显示了一个短期的细胞存活及光感受器的维持[57]，主要原因可能有：(1)RPE细胞是黏附的单层细胞，移植时需要一个适当的黏附基质；(2)RPE细胞有可能聚集成团，无法形成单层结构。最近Masayo Takahashi小组通过一个新的装置，包括一个处理过的扁平的20号导管同一个定制的活塞将一个1.3 mm×3.0 mm的hiPSCs-RPE-sheet经过视网膜下途径移植至兔眼内，而这个方法更为安全和稳定[58]。

除此之外，Meyer小组通过利用慢病毒表达Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28，成功将一位患有回旋型萎缩的患者皮肤成纤维细胞重新编程为iPSCs。回旋性萎缩是一种罕见的常染色体隐形遗传的视网膜退行性病变，主要影响RPE细胞，导致光感受器的丢失及最终致盲。实验者将iPSCs经过诱导分化，最终得到了特异性疾病的功能缺失的RPE细胞，并且通过基因靶向修复手段修复其缺陷基因，使之发育成为功能正常的色素上皮细胞。这项研究的意义不仅在于能够进一步加深对人体视网膜发展及相应疾病的研究，也提出了人类iPSCs在患者个体化治疗方面的巨大应用前景[59]。随后，Phillip等[60]通过以MMLV为基础的逆转录病毒，表达 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28，成功将人外周血T淋巴细胞重编程为iPSCs，继而进行诱导分化形成视网膜细胞。这项研究成果不仅证明由血细胞来源的iPSCs能够产生视网膜细胞，也为基于iPSCs的视网膜研究提供了一个更为方便的供体细胞来源。近期Masayo Takahashi等人利用Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四因子通过仙台病毒重编程至视网膜色素变性（RP）患者的皮肤成纤维细胞中，得到非整合型iPSCs，随后又通过无血清的，化学组成成分明确的培养基进行逐步分化，继而得到了神经视网膜祖细胞，视网膜色素上皮祖细胞，光感受器前体细胞，色素上皮细胞及光感受器细胞。经过连续培养后，视杆细胞的数量急剧减少，这提示了一个视网膜杆状细胞退化的体外模型的形成。研究者由此，通过RP患者皮肤成纤维细胞产生非整合iPSCs，并通过逐步诱导分化得到了视网膜杆状细胞退化的体外模型，概述了RP的疾病特征以及内质网应激在RP发生时的机制[61]。这一研究显示了iPSCs在体外疾病模型研究中的实用性。

四、iPScs在眼科临床应用的进展及前景

iPSCs技术的建立被认为是干细胞研究领域的一个重大发现和突破，由于iPSCs来源于患者自身的体细胞，将iPSCs应用到临床干细胞治疗既回避干细胞治疗涉及到的有关伦理道德问题，又避免异体免疫排斥反应，使得干细胞个体化治疗成为可能，其临床应用前景备受关注。

日本近日批准了利用iPSCs开展视网膜再生的临床研究，这是世界上首个即将进行的iPSCs临床试验。新批准的实验是从湿性老年黄斑变性患者前臂采集4 mm的皮肤组织，诱导成为iPSCs，进而分化成为色素上皮细胞，发育成为薄片状后移植入患者的黄斑受损区。研究者之所以会选择这种眼病进行临床实验，是由于视网膜细胞不易癌变，即便癌变也容易与正常组织区分，并可用激光烧灼治疗。并且，由于只需要向约2 mm见方的区域移植色素上皮细胞，移植部分便可从外部辨别是否异常，观察更加方便[62]。该项目进入临床的准备周期需要大概十个月的时间，因此2014年会进入临床实践。

尽管iPSCs在眼科临床应用方面有着诱人的前景，但是目前还有一系列问题亟待解决：（1）重编程成体细胞的细胞来源选择，尽管现在很多类型的成体细胞能够被重新编程为iPSCs，但是应用到临床中还需考虑到以下方面：细胞取材是否容易，能否保证来源，编程时间长短，以及重编程的效率高低等；（2）如何提高iPSCs诱导效率及安全性，iPSCs的重编程效率总体来说依旧不尽如人意，并且很多重编程方案也不能完全排除细胞的突变及致瘤性，因此还需寻找更为安全及高效的方法；（3）如何提高iPSCs诱导分化成视网膜细胞的效率，就目前研究来看，各种方法诱导iPSCs分化成视网膜细胞的周期都偏长，使得临床治疗的周期也相对加长；（4）如何保障移植前细胞的纯度及安全性检测，为了避免移植过程中带入未分化或者分化诱导不完全的iPSCs，需要更为可靠的安全检测。随着iPSCs重编程机制的阐明，以及干细胞在临床应用研究的不断进步，相信不久的将来利用iPSCs的干细胞个体化治疗技术必将造福于人类。

表2 iPSc分化成视网膜细胞

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