干细胞移植治疗青光眼的研究进展

罗静 张慧明 魏为 周亮 张康

干细胞移植治疗青光眼的研究进展

罗静 张慧明 魏为 周亮 张康

不可逆性的视网膜神经细胞死亡和功能丧失是青光眼、老年黄斑变性等致盲性眼病的共同原因，目前没有有效的治疗方法修复已有的病变，恢复受损的视功能。2012年Schwartz等用人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植进入临床实验用于治疗年龄相关性黄斑变性，这标志着干细胞替代治疗进入一个新的里程碑，也给青光眼的治疗带来了希望。本文综述了干细胞移植治疗青光眼的研究进展。近年的研究发现，胚胎干细胞在治疗中枢神经系统疾病中具有特别的优势，是细胞移植治疗视神经疾病包括青光眼的极具前景的来源。随着干细胞研究的不断深入，诱导多能干细胞的问世，为研究眼科难治性疾病的发病机制、开发药物治疗和进行细胞替代治疗提供了新的资源。此外，Müller细胞，骨髓干细胞的的研究也为青光眼的干细胞移植治疗提供了更多的干细胞来源。

干细胞移植；视网膜神经节细胞；青光眼

青光眼是以视网膜神经节细胞(retina ganglion cell,RGC)及其轴突渐进变性进而导致视盘的独特表现并伴随视力损失为特征的一组视神经病变疾病[1]。它是一类复杂的多因素导致的不可逆的致盲性疾病。虽然青光眼在我国的发病率低于白内障，但由于手术可以有效地解决白内障带来的视力障碍，因此青光眼成为我国首要的不可逆性的致盲性疾病，其中原发性开角型青光眼（POAG）最为普遍，但该疾病的生物学机制尚不清楚。年龄增长、非洲后裔、家族史及眼内压（IOP）升高均是POAG的主要危险因素。

不可逆性的视网膜神经细胞死亡和功能丧失是青光眼、老年黄斑病变、遗传性视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变、原发或继发性视网膜变性疾病、视神经损伤等眼部疾病的共同原因，从而导致永久性的视力丧失。而目前还没有有效的技术和方法能阻止病变进展，并有效恢复视网膜功能，从而给患者和社会带来了巨大的经济负担和社会负担。

青光眼的常规治疗方案是通过药物或者手术降低眼压，这些治疗可以有效控制这些疾病的病程进展，但却不能阻止由神经节细胞死亡导致的视力丧失。在青光眼的晚期，超过90﹪的视网膜神经节细胞被累及、凋亡，少量存活的神经节细胞已经无法逆转青光眼导致的病理性改变[2-3]。虽然这些治疗可以暂时控制这些疾病但不能修复已有的病变，阻止视力的丧失。RGC的损伤通常发生在两个步骤：原发性的损伤和继发于凋亡的变性。目前的治疗大部分是针对前者，然而即使是原发性的损伤被控制，继发性的病变仍然存在，因此，人们急切需要找到新的办法，减少视网膜神经节细胞原发和继发性的损伤，从而挽救视功能。

一、用于青光眼细胞替代治疗的供体干细胞的研究进展

（一）干细胞替代治疗进展飞速

干细胞是当今细胞生物学乃至整个生命科学研究的主要热点和前沿，干细胞因其具有自我更新、高度增殖及多向分化潜能，体内移植后可以修复和替代受损的神经细胞，使神经再生成为可能，干细胞对治疗以不可逆的细胞损伤为特点的疾病，具有极大的应用价值。多数致盲性眼病，如青光眼、黄斑变性和视网膜色素变性等，均存在着细胞损伤和变性的病理过程，干细胞移植修复和替代变性缺失的神经细胞为治疗这类致盲性眼病提供了可能性。

2010年美国食品及药物管理局批准了用胚胎干细胞来源的RPE细胞治疗黄斑变性的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，并取得良好的效果。2012年Schwartz等[4]用人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植已经进入临床实验用于治疗年龄相关性黄斑变性，这标志着眼科领域干细胞替代治疗进入一个新的里程碑，也给青光眼的细胞替代治疗带来了希望。

（二）供体干细胞的来源

成功的干细胞替代治疗依赖于供体细胞能在移植后存活、移行入理想的部位，并且分化成为视网膜细胞来挽救视功能。目前报道用于视网膜移植的干细胞主要包括胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）、骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell,BMSC）。以下将对这些细胞进行综述。

1.胚胎干细胞（ESCs）：ESCs是从哺乳动物早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）或原始生殖细胞（primary germ cell,PGC）经体外分离，抑制分化培养获得的一种具有多向分化潜能的细胞，几乎可以向所有的成年组织分化。在中枢神经系统，从小鼠、猴、人的ESCs来源的多巴胺能神经元已被显示在移植后可以在脑组织内分化并在帕金森病的动物模型中部分挽救其功能[5-9]。此外，从ESCs来源的少突细胞能修复脊髓外伤带来的损害[10-12]。

在确定的培养条件下，人胚胎干细胞（hESCs）可能分化为RGC细胞，因此有可能成为RGC移植的无限供体细胞来源。对于ESCs分化成RGC细胞的可行性已经有一些评价指标。研究发现培养的视网膜祖细胞可重复生成具有RGC细胞特有标记Tuj，Islet1和Thy1的阳性细胞，因此对于视网膜祖细胞而言分化成RGC细胞似乎存在一个特定的途径[13]。将这些视网膜祖细胞注射到小鼠玻璃体腔后可与RGC层整合。

与自发分化相比，小鼠PA6细胞系的间质细胞衍生诱导活性（SDIA）使得ESCs细胞向RGC细胞的分化更快且更有效[14]。Haruta及团队[15]利用SDIA使猴ESCs向RX+/PAX6+视网膜祖细胞分化。Aoki等[16]用SDIA处理小鼠ESCs，证明生成的RPE65阳性的RPE细胞可以整合到发育中的小鸡眼球RPE层中。利用SDIA将人ESCs细胞分化成CRALBP/bestrophin+ RPE细胞已见报道[17]。

胚胎发育学研究发现[18]脊椎动物中六种主要的视网膜神经元和一种胶质细胞是以恒定有序的方式生成的：视网膜神经节细胞（RGCs）通常最先产生。前脑的发育需要同时拮抗BMP和WNT信号通道[19-24]。为驱使ESCs向前部神经元分化，Lamba小组研究了视网膜特定的分化条件，也就是将小分子药物noggin(BMP通道的潜在的内源性的抑制剂)和Dickkopf-1[25](DKK1,Wnt/B-catenin信号通道的拮抗剂)，还有胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor-1,IGF-1）[26]添加入hESCs细胞体，培养3 d后转入包被了Matrigel或是lamin的六孔板中让其粘附。然后加入bFGF培养3周。在ESCs暴露于特定的分化条件1周，2周，3周后提取细胞RNA并分析眼源性转录因子（eye fi eld transcription factors，EFTFs）的表达，结果发现在分化后的细胞中这些转录因子，包括Rx、Pax6、Lhx2、Six3比未分化或者未干预分化的ESCs表达量增加了75 ～ 165倍。虽然以前的研究表明Noggin或者Dkk1可以促进前部神经元的分化，IGF-1的加入尤其促进了ESCs向视网膜前体细胞分化。去除该因子将急剧减少视网膜前体细胞基因表达。通过免疫组织化学染色，分化后的ESCs表达视网膜前体细胞的标记物如Pax6和Chx10。定量分析显示，条件培养液培养3周后，82﹪的细胞表达Pax6，其中，86﹪同时表达Chx10，多数Pax6 表达的细胞同时也表达Sox2。

这些数据显示在视网膜条件培养液的影响下，大部分hESCs可分化成各种类型的视网膜前体细胞。通过免疫荧光染色检测发现，这些视网膜前体细胞大部分都表达Pax6，尤其表达增高的细胞同时还表达神经节细胞和无长突细胞的标记物如HuC/D、Neuro fi lament-M和Tuj-1。其他细胞则表达感光细胞的标记物如Crx、Nrl、recoverin、S-opsin、rhodopsin以及水平细胞和无长突细胞的标记物Proxl、双极细胞的标记物PKCa。此外，qPCR的结果显示在视网膜条件培养液下培养1周，Crx的水平显著而稳定地增高，而感光细胞的其他分化标记物如opsins、PDE-B和recovery仅中度增加，但随着体外培养时间的延长，它们的表达稳定地增长。这一发现也符合视网膜发育过程中基因表达的特点：首先是Crx，然后是recoverin，PDE-B，最后是opsin。人91 d胚胎视网膜EFTF的表达和分化3周hESCs的视网膜前体细胞基因表达类似。这一结果显示hESCs在条件视网膜培养液的影响下，其基因和蛋白表达谱和人视网膜的前体细胞，神经元细胞以及感光细胞高度一致。因此，hESCs是提供视网膜神经元和感光细胞损伤后修复的优良的来源。

Lamb的研究最具突破性的地方是同正常视网膜胚胎发育相比，这种培养方法加速了视网膜的“发展”时间，在分化后不到2周的时间，细胞已经获得眼源的特征，并且可特定分化为神经视网膜。在人的胚胎期，视神经泡直到Streeter的水平11或者12[27]，或者是排卵后24 ～ 25 d才出现。内层的“原始神经母细胞层”和视神经纤维的发育，预示着视网膜神经节细胞的发生，通常在排卵后大约第6周才出现。hESC在培养3周后和91 d胎龄的人的视网膜的基因表达一致，可见hESCs加速了3 ～ 4周的正常视网膜的发育时间进程。

然而，ESCs植入视网膜下腔后容易形成玫瑰花结样的结构，且有成瘤化倾向，使得它的研究和使用受到了一定的限制。此外，ESCs的伦理学问题也仍然是目前的争论焦点之一。

2.诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）：Takahashi等[28]于2006年报道了iPSC的发现，一些研究[29-32]也证实通过四种转录因子，oct-3/4,Sox2,c-Myc和Klf4，可使自体细胞转化为iPSC。这些细胞在与ESCs培养条件相同的条件下表现出与ESCs形态、生长特性相似的特点，并表达ESCs标志基因，而且在移植到裸鼠皮下后形成的肿瘤样结构中包括了来自3个胚层的多种类型的组织，将其注入小鼠胚泡后发现iPSC可参与到小鼠的胚胎发育过程中。该研究证明了已分化的细胞通过细胞重新编程可重回到类似ESCs的未分化状态。2010年，美国学者Lamba等[33]从人成纤维细胞诱导产生诱导多能干细胞，进而诱导其向视网膜干细胞及感光细胞分化。他们将这些细胞移植到正常成年小鼠视网膜下腔，观察到供体细胞能够整合到受体并表达视网膜感光细胞标记物。这些细胞具备胚胎干细胞的特征，同时避免了使用胚胎干细胞所涉及的伦理问题。另外，可以制备针对患者的无免疫原性细胞，使自体细胞移植成为可能，避免移植后的免疫排斥反应。

目前研究认为，iPSC与ESCs相似，可被诱导分化为多种细胞类型，在眼科领域，iPSC可被诱导分化成为多种视网膜细胞类型。Parameswaran等[34]研究认为，iPSC可分化为视网膜前体样细胞，进而分化为包括光感受器（视锥、视杆）及视网膜神经节细胞在内的多种视网膜细胞类型，而且iPSC可对视网膜组织发生早期或晚期的微环境做出反应，使其分化为视网膜细胞类型具有时期特异性。iPSC的研究进展使体细胞直接编程并使其成为具有多向分化潜能的状态。

视网膜细胞的分化在分子水平被精确地调控。以前的研究证实几种眼源性的转录因子（EFTFs）-包括Pax6、Rx1、Lbx2、otx2、Six3、ET和Six6-是眼形成所必须的[35]，并且ERTFs形成了眼的自我调节系统。视网膜神经节细胞是视网膜形成过程中最先产生的细胞。Pax6、Mathematical和Notch是调节形成视网膜神经节细胞的主要特定转录调控因子[36-37]。在诱导重组的四种转录因子中，Sox2是其中一种基本的重组因子并且可能致力于使iPS细胞分化为神经源性的细胞[38-39]。Sox2在中枢神经系统的神经干细胞中表达，同时也是神经视网膜前体细胞的标记物[40-41]。Sox2在人眼的发育过程中起着关键的作用，其变异将导致无眼畸形[42]。Sox2是维持神经前体细胞的特性所必须的，条件性去除视网膜中的Sox2会导致神经前体细胞丧失竞争性分化的能力[43]。

Sox2和Pax6及Otx2相关，表达在神经盘中，并且相互配合控制眼的发育[44]。Sox2自发调节或者交叉调节Pax6，并且Sox2的表达激活Pax6在Y79细胞中的表达。此外，Sox2和Otx2蛋白直接上调和共同调节视网膜同源性基因Rx[45]。这些研究认为通过包含Sox2的转录因子产生的重组多能干细胞也许可以分化为视网膜神经细胞。Math5在决定视网膜神经节细胞形成的基因调节中起着重要的作用[46-47]。Pax6直接激活Math5[48-49]，Hes1、Hes5通过在小鼠视网膜形成过程中抑制Math5维持前体细胞的特性[50]，并且Notch活性刚好在视网膜神经节细胞分化前下调[51]。Math5在视网膜神经节前体细胞中的表达增加，启动了iPS定向分化为RGC的转录调控。

研究显示iPS细胞自身能表达视网膜前体细胞相关的基因，如Pax6、Rx、Otx2、Lbx2和nestin。通过转染Dkk1+ Lefty A（DL）和Dkk1 +Noggin（DN）上调Pax6，通过促使Math5的过量表达激活了iPS细胞中视网膜神经节细胞的基因表达，此外DAPT(r-secretase inhibitor)的应用可抑制Hes1，从而促使iPS细胞分化成神经元样的细胞。这种细胞显示有长的突触并表达Brn3b、Islet-1和Thy1.2等视网膜神经节细胞的标记物。在玻璃体腔注射细胞四周后，免疫化学检测证实细胞能够存活但不能分化整合进入正常的视网膜。分析认为正常视网膜环境能阻碍移植物的整合，但视网膜的损伤模型也许能使细胞的整合成为可能。如果受体和供体视网膜处于发育相当的时期，那么移植的细胞整合入成人或变性的视网膜中的几率将增高[52]。同样 GFAP和Vimentin缺陷的小鼠为移植细胞存活，移行和形成neuritis提供了可能的环境[53]。在缺氧损伤的条件下神经前体细胞移植入视网膜下腔的环境时能整合入受体的视网膜[54]。这些研究认为缺陷或变性的视网膜有利于移植细胞的移行，因此在小鼠的青光眼模型中移植分化的iPS细胞有可能增加移植细胞整合的效率。

3.Müller细胞：在低等脊椎动物，Müller细胞可以产生RGCs，甚至成年动物的视神经可以再生。而在脊椎动物，Müller细胞可能同样具有成为神经再生的细胞来源之一[55]。一种自发性的永生型Müller细胞系显示了干细胞样的特征，它在合适的培养条件下能移行和分化为不同的视网膜细胞类型[56-57]。在青光眼的动物模型中，通过调节细胞外基质和控制微胶质的活性，可以促进Müller细胞移行入RGC层[58-59]。

Müller细胞是视网膜干细胞/前体细胞产生的胶质细胞[60]，它从内界膜一直延伸到外界膜贯穿了整个视网膜。Müller细胞的神经突在视网膜不同类型的神经元细胞胞体中分布，并且和视网膜神经元形成进一步的连接[61-62]。近年的研究表明Müller细胞是潜在的视网膜干细胞，不同类型的刺激物可以诱导斑马鱼、鸡和成年大鼠视网膜Müller细胞的再分化[63-65]。这些重新分化的视网膜Müller细胞呈现出干细胞的特性，并能分化为神经元，包括视网膜神经节细胞。然而，在上述研究中神经节细胞分化的效率太低，不足以替代和补偿在神经元疾病包括青光眼中受损或者死亡的视网膜神经节细胞。因此，促进Müller细胞向视网膜神经节细胞的分化也将成为青光眼或者视神经变性疾病的另一种方法。

目前有两种方法用于诱导视网膜Müller细胞的重新分化，一种是使用N-methyl-D-aspartate（NMDA）或者其他化学物诱导损伤，另一种方法是加入不同的细胞生长因子。最近，Song等[66]使用无血清的培养基DMEM/F12中添加EGF、bFGF、BDNF和RA，从而诱导出视网膜Müller细胞的再分化。Atoh通过抑制Notch1的表达，促进了具有干细胞分化特性的Müller细胞体外向中视网膜神经节细胞分化，使分化后的细胞表达特异性的标记物Brn3b和Isl-1。

4.骨髓干细胞：骨髓中至少存在2种多能干细胞，即造血干细胞（HSC）和骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell,BMSC）。

HSC是目前研究最成熟的干细胞类型，容易获得，体外培养能大量扩增并保持多向分化的潜能，能分化为神经细胞和神经胶质细胞。HSC是体内各种血细胞的唯一来源，主要存在于骨髓、外周血、脐带血中，是最早应用于临床治疗的干细胞。在小鼠和人中已经有多种方法用来分离和标记HSC。在多种视网膜变性疾病中，除光感受器细胞变性外，还常常伴随着视网膜血管萎缩的出现。研究表明，骨髓来源的Lin-HSC含有内皮祖细胞，能够稳定和恢复变性的视网膜血管，同时还具有神经保护作用。

BMSC则是骨髓中一类可以向多种非造血细胞分化的干细胞，数量少，成人骨髓平均每10万个有核细胞中含有1个，随着年龄的增加，细胞数量逐渐减少，且在生理状态下20﹪为静止期细胞，具有强大的扩增能力。BMSC不仅具有较强的自我复制能力，而且在体内外还具有多分化潜能，在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱、肌肉细胞和神经细胞等多种细胞。此外，作为中胚叶干细胞在一定的微环境和（或）诱导剂存在时，能跨系分化为外胚叶的视网膜细胞，并具有较强的分化潜能。研究者将BMSC移植至视网膜损伤或变性大鼠的玻璃体腔或视网膜下腔后，观察到移植细胞主要与视网膜外核层发生整合，并表达成熟视网膜神经细胞的标记物。Li等[67]在动物模型中证实：成人骨髓来源的干细胞能够在体内诱导成RPE。

骨髓干细胞既可以用于细胞替代治疗，也可以通过分泌细胞因子发挥神经保护作用。玻璃体腔注射神经营养因子可以在动物模型如RP、青光眼模型、视神经损伤模型中减少感光细胞的变性，但其效果是短暂的。缓释药物和基因治疗是两种长期作用的诱导细胞分化神经营养因子的办法，第三种办法是使用干细胞作为长期传递系统，因为骨髓干细胞自身就分泌神经营养因子或者可被诱导分泌神经营养因子[68-70]。

二、目前存在的问题和挑战

尽管干细胞的替代治疗有迷人的前景，但在当前干细胞研究中也存在着大量亟待解决的问题，如取材和移植的方法、诱导分化、功能重建和消除免疫排斥反应等。因此仍有许多因素如安全等需要慎重考虑并严格进行验证。

从hESCs分化生成RGCs并作为健康的移植物取代青光眼中丧失的RGCs为患者带来希望，但是这种方法仍存在局限性。不同hESC细胞系生成的RGCs的质量存在着相当大的差异，而且使用新鲜的胎儿组织有明显的局限性[71-72]。更重要的是，来源于hESCs的RGC不再是自体同源，RGC细胞移植可能导致急促而显著的移植排斥反应。利用自体的体细胞诱导形成iPSC，从而生成RGC是免除RGC移植后需要长期全身使用免疫抑制的一种方法。但是由于iPS细胞的转化中使用癌基因及逆转录病毒，肿瘤形成的危险性有待进一步确定。HSC容易获得、体外扩增培养并可自体移植，在体外培养条件下多代扩增后仍保持多向分化潜能的特点，且体内植入免疫排斥反应弱，不存在伦理学问题等特点赋予它诱人的应用前景。缺点是中胚叶起源的HSC向神经外胚叶起源的视网膜细胞分化率低。

此外，更要清醒地认识到，体外诱导RGC的分化，只是干细胞替代治疗的第一步。如何提高其转化效率、寻找到有效的移植途径、利用生物材料促进体内RGCs的存活和体内分化、生长并形成功能性的连接，从而使RGC的治疗能够真正应用于临床治疗青光眼或者其他视神经疾病将是人们进一步探索的方向。

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Current approaches and future prospects of stem cells for glaucoma

Luo Jing*,Zhang Huiming ,Wei Wei,Zhou Liang,Zhang Kang.*Department of ophthalmology,The Second Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410011,China

Zhang Kang,Email:kang.zhang@gmail.com

Irreversible retina neuron cell damage and dysfunction is the main pathology of blindness eye diseases such as glaucoma and age related retinopathy.However,no treatment showed efficiency to replace the damaged cells and restore the visual function.In 2012,human embryonic stem cells (hESCs) were successfully differentiated into retina pigment epithelial cells and were evaluated in a clinical trial for human age related macular disease.It’s a milestone of stem cell regenerative medicine,which also brought hope for glaucoma treatment.Our review focused on the progress of stem cell transplantation strategy on retina ganglion cell replacement research.Recent studies found that ESCs have advantage in differentiation and function on rescuing central nervous system disease,which indicates that ESCs are excellent resource for treatment of neuron diseases including glaucoma.Furthermore,induced progenitor cells also provided new resource for studies of mechanism of eye diseases,drug delivery system and cell replacement treatment.In addition,Müller cells and bone marrow stem cells provided more stem cell resource for the future cell regenerative medicine.

Stem cell transplantation；Retinal ganglion cells；Glaucoma

2014-02-10)

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.009

410011 长沙，中南大学湘雅二院眼科（罗静、张慧明、魏为、周亮)；四川大学华西医院眼科（张康）；美国加州大学圣地亚哥分校基因医学和Shiley眼科中心

张康,Email: kang.zhang@gmail.com

罗静,张慧明,魏为,等.干细胞移植治疗青光眼的研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(2):130-137.