干性年龄相关性黄斑变性的干细胞治疗——现状及展望

党亚龙 徐永胜 张纯

干性年龄相关性黄斑变性的干细胞治疗
——现状及展望

党亚龙 徐永胜 张纯

年龄相关性黄斑变性(AMD)不仅是发达国家，而且也是发展中国家主要的、不可逆的致盲眼病。过去的十多年中，新生血管性AMD（湿性AMD）的治疗方法已经发生了巨大变化。然而，以黄斑地图样萎缩为特征的非新生血管性AMD（干性AMD）仍然无有效的治疗方法。干细胞科学最新进展证实：RPE细胞能够以共培养或特定诱导因子从干细胞分化获得。同时，研究显示RPE细胞移植能够维持模型动物的视功能。更重要的是，美国FDA已经批准一些基于干细胞的RPE移植临床试验，而且得到了令人鼓舞的成果。这篇综述将重点从RPE细胞诱导方法、细胞活体移植研究、临床试验及存在的问题等方面加以综述。

黄斑变性；干细胞；色素上皮，眼

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是我国65岁以上人群的主要致盲眼病之一，发病率逐年上升[1-4]。AMD按照有无脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)存在，分为干性AMD和湿性AMD。随着对CNV发生机制的深入研究，抗血管内皮细胞生长因子类药物、光动力疗法、激光光凝及玻璃体切除手术在不同时机的应用，湿性AMD得到了一定程度的控制[5-7]。

干性AMD主要是由于氧自由基和脂质过氧化物等在视网膜内蓄积，局部慢性炎症活化，导致视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡及继发的光感受器细胞损伤，目前尚无确切的药物疗法[8]。因此，细胞替代及视网膜微环境调控成为治疗干性AMD的新思路。

干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，能分化为RPE细胞和光感受器细胞，是细胞替代的来源之一。另外，干细胞，特别是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)还有免疫调节、抑制神经细胞凋亡的作用，能够维持和调节视网膜微环境。近年来，大量基础研究及I/II期临床试验对干性AMD的干细胞治疗进行报道，本文将从干细胞来源的RPE细胞替代、干细胞对视网膜微环境的调控两个方面加以综述。

一、干细胞来源的RPE细胞替代

健康、有活力的RPE细胞是干性AMD患者理想的替代细胞。按照细胞来源分为：干细胞来源的RPE细胞、胎儿/成体RPE细胞、虹膜色素上皮细胞、自体RPE细胞等[9-11]。由于后三种细胞来源有限、分离纯化困难、增殖能力差等，应用受到了限制。

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)、诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)及成体干细胞均可以在一定的条件下分化为成熟的有功能的RPE细胞。

(一)ESC来源的RPE细胞替代

ESC来源的RPE细胞替代治疗是目前研究的热点。按照获取RPE细胞的方法不同，分为7类：自然分化发法、基质细胞诱导法(stromal cell derived inducing activity,SDIA)、无血清拟胚体悬浮培养法(serum-free embryoid body-like,SFEB)、小分子诱导法、视网膜决定法(retinal determination,RD)、神经球团分选法(spherical neural masses,SNMs)和3D视网膜诱导法。

1.自然分化法：约1﹪的ESC可自动分化为RPE细胞[12]，这些细胞具备成熟RPE的标记，将这些细胞移植到RCS大鼠(royal college of surgeons rat,RCS rat)的视网膜下，发现移植细胞具有极性，能与宿主的光感受器整合，能吞噬脱落的光感受器外节，维持大鼠的视功能[12-13]。对免疫抑制模型动物的视网膜下移植还发现了无畸胎瘤及其他病理变化[14]。

虽然该方法分化效率很低，但没有诱导剂及导入潜在的致病基因等，美国FDA批准其为Good Manufacturing Practices(GMP)标准[14]。2011年，美国Advanced Cell Technology(Santa Monica,California,USA)应用该技术开展了hESC来源的RPE移植I/II期临床试验（注册号：NCT01345006、NCT01344993），治疗对象：干性AMD、Stargardt’s病[14]。2012年，Schwartz等[15]报道了初步研究成果：两位患者（AMD、Stargardt’s病各1例）通过玻璃体切除手术在视网膜下腔特定部位植入了5 × 104个RPE细胞。有效性：（1）在随访的4个月内，移植物均存在；（2）两例患者的视力均得到一定程度的提高：干性AMD患者的视力从21个字母提高到28个字母，Stargardt’s病患者的视力从0个字母提高到5个字母（均为early treatment diabetic retinopathy study,ETDRS视力表）。安全性：两例患者均未发现细胞异常增殖、免疫排斥等现象。研究还发现RPE分化的状态与细胞贴附和生存相关，轻度色素脱失的RPE细胞具有更好的增殖和贴附能力。

尽管初步研究显示了RPE细胞移植的良好应用前景，但仍有一些问题有待克服：(1)RPE成熟度状态决定了移植后增殖和存活能力，因此选择合适分化程度的RPE细胞是治疗成功的关键；(2)用作诱导的hESC不能含致病基因；(3)如何得到极高纯度的RPE也是一个重要的课题。

2.SDIA法：2000年，Kawasaki等[16]命名了SDIA法。2002年，他用SDIA法从灵长类动物的ESC诱导出了(8 ± 4)﹪RPE细胞[17]。后来，他对这些RPE细胞进行了蛋白标记、吞噬功能及RCS大鼠的视网膜下腔移植实验，证实这些细胞能够促进宿主光感受器细胞的生存[18]。该法的优点是没有添加外源性的诱导剂，但是存在PA6基质细胞污染的可能。另外，SDIA法未报道能诱导出光感受器样细胞，因此临床应用前景有限。

3.SFEB法：2005年，Ikeda等[19]应用mESC无血清拟胚体(serum-free embryoid body-like,SFEB)悬浮培养，能够诱导mESC分化为Rx+/Pax+的视网膜前体细胞。经过四年的探索，该团队成功的获得了(23.8 ± 2.7)﹪的RPE前体细胞、(11.5 ± 2.0)﹪红绿视蛋白阳性的视锥细胞、(10.7 ± 1.6)﹪蓝色视蛋白阳性的视锥细胞和(17.2 ± 1.8)﹪视杆细胞[20]。遗憾的是，SFEB法诱导产生的细胞整合到宿主视网膜的能力较低[21]，主要原因：（1）SFEB法诱导产生的视网膜前体细胞比例低；（2）虽然SFEB法模拟了视网膜发育的过程，但所得细胞发育较为成熟，自身的整合能力较差[22]。

4.小分子诱导法：Osakada等[23]在外源性添加CKI-7(Wnt抑制剂)和SB-431542(Nodal抑制剂)能够获得了(18.1 ± 1.9)﹪的RPE细胞，这些细胞具备成熟RPE的形态、蛋白标记和吞噬能力。小分子诱导具有以下优点：（1）诱导剂属于化学制品，不同批次和厂家之间差异较小；（2）避免了生物制品的诱导剂可能造成的污染和交叉反应；（3）价格相对低廉，有助于普及应用。但是，该方法没有经过动物实验，其安全性、有效性尚待深入研究。

5.RD法：Lamba等[24]应用Noggin(BMP通路抑制剂)、DKK1(Wnt/β-catenin通路抑制剂)和IGF-1，得到高达(82 ± 23)﹪ Pax+的视网膜前体细胞，其中86﹪的细胞也表达Chx10。将这些细胞移植到Crx-模型鼠的视网膜下腔可以改善视功能[25]。RD法最突出的优点在于能够在短时间内收获大量的视网膜前体细胞。

6.SNMs分选法：2008年，Cho等[26]发现拟胚体形成后经过神经前体细胞选择及扩增，可以得到SNMs。其中，大约有5﹪囊泡样结构最终分化为RPE细胞[27]。SNMs法具有以下优点：（1）没有外源性添加诱导剂，避免了污染和免疫反应的可能；（2）SNMs来源RPE细胞更接近人体内RPE产生过程；（3）SNMs缩短了从ESC转化为RPE的时间。但迄今为止，该方法没有进行严格的动物实验来验证所得到的RPE是否具有功能。

7.3D视网膜诱导法：2011年，Eiraku等[28]应用SFEB法在matrigel构建的3D培养体系内成功模拟了视网膜发育的过程。随后，Zhu等[29]利用matrigel构架的3D体系在Activin A存在的情况下30 d之内分化为RPE细胞并能有效整合在模型动物的RPE层。

（二）iPS来源的RPE细胞替代

2006年，Yamanaka等[30]报道小鼠成纤维细胞可以诱导成为ESC样细胞，命名为诱导多能干细胞。iPS具有ESC类似的形态和分化能力，在不同的诱导条件下能够分化为3个胚层的细胞。iPS还具备独特的优点：(1)来源广泛；(2)理论上无免疫原性，由于iPS来源于自身的成熟体细胞，利用iPS分化而来的细胞进行细胞移植时可以避免种属或者个体间的排斥反应；(3)无伦理学争议；(4)iPS还可以构建疾病模型及测试药物。

与ESC类似，iPS具备分化为RPE及光感受器细胞的能力。iPS来源的RPE表达成熟RPE的蛋白标记，具备吞噬能力，iPS来源的RPE已经成功的移植到模型动物并发挥功能[31-36]。

尽管用于诱导ESC的各种方法大多适合iPS的诱导，但不同的iPS细胞系间仍存在较大差异。Hirami等报道[20]，在完全相同的诱导条件（SFEB/ DL）下，201B7细胞系和253G1细胞系可以诱导分化为RPE细胞，而201B6细胞系则不能。在蛋白表达上，在向RPE分化的第6天mESC即可发现Rx+/ Pax+细胞，但部分iPS细胞系则需要15 d。这可能与iPS本身基因组特性有关，但也可能与培养环境及分化程度有关。

iPS虽然有各种优点，但缺点同样不可忽视：(1)iPS来源于患者，所以可能携带致病基因，只有当致病基因被修复后，iPS诱导所得的细胞才能安全的移植入受体[37]；(2)iPS潜在的致瘤风险。Hirami等[20]发现，在iPS分化的第15天，仍有(0.60 ± 0.04)﹪的细胞NANOG+。

（三）MSCs来源的RPE细胞替代

尽管RPE和光感受器细胞来源于神经外胚层，但MSCs具备跨胚层分化的能力。Huang等[38]报道，应用光感受器外节和RPE细胞条件培养基能够诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为具备形态和吞噬功能的RPE细胞，但这些RPE细胞也未经过严格的动物实验。

另外，在某些特定条件下，MSCs还可在受损的视网膜内进一步分化，发挥细胞替代作用。Gong等[39]对碘酸钠诱导的RPE损伤大鼠视网膜下注射BM-MSC，5周后发现BM-MSC可以转化为RPE、光感受器及胶质细胞。Tomita等[40]发现MSCs能够迁徙至机械损伤大鼠的视网膜内（主要是内核层），转化为表达GFAP、Calbindin、Rhodopsin、Vimentin的视网膜细胞。Castanheira等[41]对激光损伤模型大鼠的玻璃体腔内注射MSCs，经过8周，大多数MSCs已经迁徙至神经节细胞层、内核层和外核层。这些细胞表达光感受器细胞、双极细胞、无长突细胞、Müller细胞的标记。

（四）视网膜干细胞(retinal stem cells,RSCs)来源的RPE细胞替代

鱼类和两栖类动物的RSCs存在睫状体边缘带（ciliary marginal zone，CMZ），当视网膜受损时，CMZ能够不断产生新的神经元。成熟的哺乳类动物的视网膜缺乏再生能力，但Tropepe等[42]发现成熟小鼠的CMZ细胞具备增殖及分化为视网膜神经元（视杆细胞、双极细胞）及神经胶质细胞的能力，他认为这类细胞是RSCs。Aruta等[43]在分离RSCs的基础上，添加亚油酸、亚硒酸、胰岛素、转铁蛋白和甲状腺素等诱导因子成功将RSCs诱导分化为具有极性和吞噬功能的RPE样细胞。与MSCs类似，该方法得到的RPE样细胞也未经过动物实验验证其安全性和有效性。然而，哺乳类RSCs存在与否仍备受争议。Cicero等[44]认为来源于CMZ的RSCs实际上是睫状体上皮细胞。他从分子、细胞及形态学特征上证实这些细胞与分化的睫状体上皮细胞无明显差异。他还认为已分化的细胞也可以形成克隆球、自我更新、表达前体细胞的标记等。Gualdoni等[45]发现所谓的RSCs在光感受器细胞分化培养基内并不能活化Nrl（光感受器细胞分化的关键基因）。

另外，Müller细胞曾被视为RSCs。Bernardos等[46]报道，斑马鱼的Müller细胞能够低水平的表达PAX6（视网膜前体细胞的标记）和Crx(光感受器细胞的标记)。Song等[47]发现：Atoh7（Notch通路抑制剂）能够促使Müller细胞转化为视网膜神经节细胞。Müller细胞由神经视网膜前体细胞发育而来，而且分化的最晚（神经视网膜发育顺序依次是：视网膜神经节细胞、视锥细胞、无长突细胞、水平细胞、视杆细胞、双极细胞和Müller细胞），而RPE前体细胞与神经视网膜前体细胞分层发育发生在胚胎早期。因此，Müller发育为RPE细胞的难度很大。

二、干细胞对视网膜微环境调控

氧化应激损伤、炎性因子活化和视网膜营养缺乏是干性AMD的发病机制之一[8]。干细胞，特别是MSCs具有多种生物学作用：分泌营养因子、促进血管生成、调节免疫反应、抗凋亡、促进细胞外基质的重塑及活化相邻的宿主干细胞[48]。另外，免疫原性低的MSCs，也是一种良好的载体：通过外源性的导入神经营养因子，也可以在宿主体内表达，发挥生物学作用。因此，MSCs也可用于治疗干性AMD。

根据来源不同，MSCs可分为骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）、脐血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)、脐带间充质干 细 胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)、胎盘间充质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells,PD-MSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose tissue derived stromal cells,ASCs)等。BM-MSCs是研究最广泛、最深入的一类MSCs，本文将重点综述BM-MSCs对干性AMD的研究及应用现状。

（一）MSCs对视网膜微环境的调控

1.MSCs能够分泌神经营养因子：Inoue等[49]发现BM-MSCs条件培养基可以延缓光感受器细胞的凋亡，BM-MSCs注射入RCS大鼠的玻璃体腔后，光感受器退化延缓，视网膜功能得到一定保护。这提示：BM-MSCs可能分泌一些因子抑制光感受器细胞凋亡。Zhang等[50]发现光损伤模型中，玻璃体腔内注射的BM-MSCs能够表达BDNF，保护外核层视网膜细胞。Xu等[51-52]的研究提示MSCs能够表达bFGF促进光损伤模型大鼠的神经细胞保护。Wang等[53]还对RCS大鼠尾静脉注射BM-MSCs 1 × 106，结果显示：注射组的外核层细胞存活率显著高于对照组；视功能和电生理得到明显改善，血管渗漏减轻；RT-PCR及免疫组化显示：生长因子及视网膜营养因子表达上调。

2.MSCs能够抑制局部炎症：Xu等[51-52]发现玻璃体腔注射BM-MSCs能够抑制小胶质细胞活化，减轻视网膜损伤。

3.MSCs能抑制神经细胞凋亡：Otani等[54]研究发现玻璃体腔注射BM-MSCs后，视网膜抑制凋亡基因表达显著上调，包括一些小分子的热休克蛋白和转录因子。

4.MSCs可整合入宿主的视网膜：Arnhold等[55]对rhodopsin敲除的视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa,RP）模型小鼠玻璃体腔内注射mBM-MSCs，发现mBM-MSCs不仅整合入宿主的RPE层和神经上皮层，而且显著的保护了光感受器细胞。

值得注意的是：（1）不同来源的MSCs在宿主眼内的存活及整合能力不同，玻璃体腔注射的UCB-MSCs很少迁徙至宿主视网膜，而且其生存期也仅仅3周[56]，而BM-MSCs存活时间可达20周并有良好的整合能力[57]；（2）不同种属和类型的MSCs对视网膜神经细胞的保护作用也不相同，Levkovitch-Verbin等[58]发现人源的BM-MSCs都能够保护视网膜神经节细胞，但大鼠来源的BMMSCs无保护功能；Huang等[59]研究还提示：表达CX3CL1的MSCs促进光损伤视网膜修复的能力最强；（3）在不同的移植方式下，MSCs对视网膜的保护作用也不相同，Tzameret等[57]对比了玻璃体腔注射和视网膜下薄膜植片的移植效果：两者作用持续时间分别为12周、20周，ERG b波振幅：玻璃体腔注射56.4 μV，视网膜下薄膜植片是66.2 μV；（4）不同的视网膜微环境也影响MSCs在宿主眼内功能的发挥。

基于成功的动物实验，一些眼科学者审慎的开展了MSCs的I/II临床试验。2005年Kumar等[60]对25例干性AMD和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)患者的玻璃体腔注射自体BM-MSCs，注射后1个月及3个月患者的视力得到了轻度改善。2010年Jonas等[61]（注册号：NCT01068561）报道了3例接受玻璃体腔注射BMMSCs的患者（干性AMD 1例）。患者初始视力：光感（光定位差），接受BM-MSCs注射后，12个月随访视力并无明显改善，但无严重并发症存在，仅在治疗后4周眼压有所波动（15 ～ 30 mmHg）。Siqueira等[62]对3例RP患者和2例锥杆细胞营养不良患者的玻璃体腔注射BM-MSCs 1×107/眼，结果显示：1周后，4例患者视力提高1行并维持到随访结束。2例患者的电生理有轻度改善，眼底血管造影、光相干断层扫描及视野等无明显变化，在随访期间无并发症。虽然目前仅有的少数几个临床试验的结果并不令人振奋，但我们需考虑到以下影响因素：（1）入组患者的年龄均较大，自体BM-MSCs增殖能力及活力有限；（2）入组患者的均处于该疾病的晚期，视力极差，恢复困难。

（二）基因修饰的MSCs对视网膜细胞的作用

随着细胞工程的发展，MSCs逐渐成为一种有前景的载体细胞。Guan等[63]将MSCs注射入碘酸钠损伤模型大鼠视网膜下腔，发现经EPO修饰的MSCs的大鼠玻璃体腔内EPO的含量上升，神经细胞保护作用强于普通MSCs。Machalinska等[64]也发现转入NT-4基因的MSCs能够迁徙至视网膜损伤区域，保护受损的视网膜细胞。更重要的是，NT-4修饰的MSCs能够上调与细胞生存相关的信号及转录因子，如crystallin β-γ超家族。另外，还能上调与视觉感知、视觉信号接收及眼发育等相关的蛋白。Park等[65]观察了BDNF修饰的rBM-MSCs视网膜下和玻璃体腔移植效果，发现4周后，15.7﹪的rBM-MSCs整合入模型大鼠的视网膜，并且视网膜BDNF mRNA和蛋白水平上调。

基因修饰的MSCs除具备基本的视网膜微环境调控作用外，还被赋予了与导入基因相匹配的特殊功能，因此具有较好的应用前景。但对于干性AMD来说，导入基因的种类及途径等都需要详细研究，同时其安全性、有效性也需要进一步评估。

三、展望

人类对干细胞生物学特性、诱导方法、移植手段等不断深入的研究促使细胞治疗逐渐由梦想变为现实，但真正的使干细胞应用于临床实践还有很多困难：（1）现有的临床试验样本量非常小，其安全性还有待大样本、多中心研究；（2）虽然眼内被认为是免疫赦免区域，但研究表明[66]：移植细胞在宿主体内长期生存仍需要免疫抑制，因此，免疫抑制持续的时间、推荐剂量等也需要详细探讨；（3）具有不同发病机制及病理过程的疾病可能均表现为RPE或光感受器细胞的丧失。不同疾病所需细胞移植的种类、分化程度、移植量、移植方式等都需要进一步探讨。

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Stem cells-based therapies for dry type of age related macular degeneration: current status and future prospects

Dang Yalong,Xu Yongsheng,Zhang Chun.Department of Ophthalmology,Peking University Third Hospital

Age related macular degeneration (AMD) is one of the leading causes of irreversible visual impairment in the developed and developing countries.The management of neovascular AMD (wet AMD) showed remarkable progression in the past decade.However,nonneovascular AMD (dry AMD) characterized by geographic macular atrophy still cannot be cured.Recently,it is demonstrated that retinal pigment cells may be generated from the stem cells by defined factors or cell co-culturing.Studies also showed cell transplantation may restore visual function in vivo.Moreover,several clinical trails approved by the FDA have showed the promising prospect in stem cells-based therapies in dry AMD.This review will focus on recent advances in stem cell-based RPE differentiation,cell transplantation,clinical trials and the obstacles that must be overcomed for stem cell therapy in dry AMD.

Macular degeneration；Stem cells；Pigment epithelium of eye

2014-02-10)

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.008

教育部高等学校博士学科点专项科研基金（编号：20100001120100）

100191 北京，北京大学第三医院眼科(党亚龙、张纯)，临床干细胞研究中心（徐永胜）

张纯，Email：zhangc1@yahoo.com

Correspondence: Zhang Chun,Email:zhangc1@yahoo.com

党亚龙,徐永胜,张纯.干性年龄相关性黄斑变性的干细胞治疗——现状及展望[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(2):122-129.