骨髓间充质干细胞对脑缺血新生小鼠运动行为状态异常的疗效观察

王亚莉 陈国军 王金福 方凤 崔玉华 张青 王迪 张静

骨髓间充质干细胞对脑缺血新生小鼠运动行为状态异常的疗效观察

王亚莉 陈国军 王金福 方凤 崔玉华 张青 王迪 张静

目的观察人骨髓间充质干细胞对脑缺血小鼠行为的影响。方法40只7 ～ 8日龄新生鼠随机分为假手术组13只，仅做颈部皮肤的切开缝合，未结扎双侧颈总动脉；手术组12只，结扎双侧颈总动脉；干细胞移植组15只，结扎双侧颈总动脉后4 d，给本组小鼠心腔注射骨髓间充质干细胞0.15 ml（含骨髓间充质干细胞106）。同时给假手术组和手术组小鼠心腔注射0.15 ml生理盐水。应用动物行为学平台（转棒仪和旷场试验）对36 ～ 37日龄小鼠进行运动和行为功能测定。运动状态以及行为状态假手术组和手术组以及干细胞移植组3组采用随机F检验及两两比较。结果（1）干细胞移植组和假手术组小鼠运动降落的潜伏期明显长于手术组，而假手术组和干细胞移植组的小鼠运动降落的潜伏期长短无差异（F= 8.525，P= 0.001）；（2）在旷场实验中3组小鼠跨格次数，运动的总路程以及平均速度比较均无差异（均P> 0.05）；（3）干细胞移植组和假手术组小鼠周边活动时间和距离明显长于手术组（F= 8.370，P= 0.001），而假手术组和干细胞移植组的小鼠周边活动时间和距离长短无差异（F= 3.541，P= 0.039）；（4）干细胞移植组和假手术组小鼠中心活动时间及路程明显短于手术组（F= 7.201，P= 0.002），干细胞移植组和假手术组小鼠中心活动的时间和距离比较无差异（F= 6.044，P= 0.005）。结论脑缺血小鼠的运动和行为状态明显受损，骨髓间充质干细胞移植可明显改善脑缺血小鼠运动和协调能力和认知能力。

骨髓间充质干细胞；脑缺血；小鼠；运动行为

脑缺血疾病是导致新生儿死亡和神经系统伤残的主要原因之一，主要表现为运动发育落后或各种运动障碍，也可伴有智力低下、癫痫、行为异常以及感知觉障碍等。由于综合治疗策略对中重度脑缺血损伤收效甚微[1-2]，患儿给家庭和社会均造成沉重的负担。近年来，随着干细胞研究的进展，干细胞移植为缺氧缺血性脑损伤（H IBD）的治疗开辟了新的途径[3-4]。本实验采用乳鼠制作脑缺血模型[5-6]并给予骨髓间充质干细胞移植治疗，采用转棒及旷场实验来分析小鼠的运动及认知行为的改变来观察疗效，为临床治疗提供科学的理论依据。

材料与方法

一、动物和实验分组

40只Wister新生子鼠购自上海斯来克实验动物有限责任公司，体质量18 ～ 22 g，在复旦大学国家标准啮齿类动物实验室饲养，20 d母乳喂养，10 d分笼饲养，自由进食饮水。饲养条件：室温（22 ± 2℃），湿度45﹪～ 55﹪。分为对照组（正常组，假手术组）13只、脑缺血（手术组，双侧颈总动脉结扎组）12只、脑缺血骨髓间充质干细胞移植组15只，动物实验获得伦理委员会的批准。

二、模型制备方法

（1）对照组（正常组，假手术组）：7 ～ 8日龄（P7-8）Wistar乳鼠用10﹪水合氯醛300 mg/kg麻醉并固定台上，仰卧位作颈腹侧正中切口，长2 ～ 3 cm，不做颈总动脉结扎，皮肤缝合并用青霉素注射液冲洗局部皮肤。（2）脑缺血干预组 ：7～ 8日龄（P7-8）Wistar乳鼠用10﹪水合氯醛300 mg/kg麻醉并固定台上，仰卧位，常规消毒颈部皮肤，作颈腹侧正中切口，长2 ～ 3 cm，仔细分离左侧颈总动脉，在左侧颈总动脉其远心端与近心端分别缝线结扎；再分离右侧颈总动脉，在右侧颈总动脉其远心端与近心端分别缝线结扎；缝合皮肤，再次消毒创面。术后在37 ～ 38℃衡温毯复温4 ～ 6 h后返笼饲养。术后由母鼠喂养[5-6]。

三、人骨髓间充质干细胞制备与移植

1.人骨髓间充质干细胞制备方法：人骨髓标本采集标本来自脑瘫患儿，患儿在接受自体骨髓间充质干细胞转化神经干细胞移植治疗后，剩余的细胞冷冻，细胞复苏后用于实验。当细胞数量达到108时，用PBS清洗2次后，滴加0.05﹪的Ttypsin-EDTA液消化，后加培养基终止消化，制成(1 ～ 3) × 106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示CD34阴性，CD109阴性，CD29和CD44阳性率均> 95﹪。移植治疗之前对细胞培养上清液进行EB病毒、巨细胞病毒、HIV病毒、乙肝病毒、支原体、细菌培养、真菌培养均阴性。

2.人骨髓间充质干细胞移植组：完成动物脑缺血模型制作后4 d，也就是小鼠（P11-12）11 ～12 d大小时给脑缺血骨髓干细胞干预组小鼠心脏注射人骨髓间充质干细胞0.15 ml（含骨髓间充质干细胞106）。同时给对照组及脑缺血组小鼠0.15 ml生理盐水心脏注射。神经行为状态评定：术后29 ～ 30 d（P36-37）在复旦大学脑科学研究院的动物行为学实验室对Wister大鼠进行旷场试验和平衡能力测试，记录数据。（1）MedAssociates美国大鼠转棒仪（型号：ENV-575），该转棒仪分为4道，可同时检测4只动物。转轴选择匀加速为2.0 ～ 20、2.5 ～ 25、3.0 ～ 30、3.5 ～ 35及4.0 ～ 40 rpm。当动物从转轴上掉落时，切断该道的红外线，仪器自动记录下时间；（2）Med Associates美国大鼠旷场实验系统（型号：MEDVOF-RS）。实验装置由旷场反应箱和数据自动采集和处理系统两部分组成，大鼠旷场反应箱高30～ 40 cm，底边长100 cm，内壁涂黑，底面平均分为25个4 cm × 4 cm小方格，正上方2 m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。实验室背景噪音控制在65 dB以下。观察时间10 min。

四、观测项目和统计方法

1.观测指标：转棒仪测试选择小鼠降落的潜伏期（即在转棒仪上的运动时间）作为参考指标。比较旷场试验10 min总体反应结果，选择子鼠在旷场中的总路程、平均速度、跨格次数和中心与周边区域活动时间及距离作为参考指标。

2.统计学分析方法：采用SPSS13.0统计软件，各组数据采用形式表示。运动状态以及行为状态假手术组和手术组以及干细胞移植组3组采用随机F检验及两两比较，以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、运动状态结果

用转棒仪测定小鼠运动状态，结果见表1，干细胞移植组和假手术组小鼠降落的潜伏期明显长于手术组，而假手术组和干细胞移植组的小鼠运动降落的潜伏期长短无差异（F= 8.525，P= 0.001）。

表1 小鼠运动状态(± s)

表1 小鼠运动状态(± s)

注：a与2组比较，b与3组比较，P< 0.05

组别 例数 降落的潜伏期（s）假手术组① 13 159.700 ± 21.002a手术组② 12 131.615 ± 20.174b干细胞移植组③ 15 170.934 ± 30.867F值 8.525P值 0.001

二、行为状态结果

用旷场反应测定大鼠行为状态（表2）。在旷场实验中3组小鼠除平均速度（P= 0.020）外，跨格次数和运动总路程比较均无统计学意义（P> 0.05）。

表2 旷场总体反应结果(± s)

表2 旷场总体反应结果(± s)

注：a与2组比较，b与3组比较，P< 0.05

组别 例数 总路程 平均速度 跨格次数假手术组① 13 1192.488 ± 120.360 28.061 ± 0.887 259.142 ± 36.439手术组② 12 1245.633 ± 293.598 27.172 ± 1.667 259.714 ± 86.969干细胞移植组③ 15 1133.93 ± 203.242 28.609 ± 1.160 238.889 ± 56.472F值 0.913 4.351 0.509P值 0.410 0.020 0.606

表3 旷场周边和中心区域活动状态结果(± s)

表3 旷场周边和中心区域活动状态结果(± s)

注：a与2组比较，b与3组比较，P< 0.05

组别 例数 周边区活动t 周边区活动d 中心区活动t 中心区活动d假手术组① 13 241.059 ± 21.122a 991.691 ± 124.106a 53.600 ± 15.718a 300.796 ± 60.418a手术组② 12 226.730 ± 9.557b 859.062 ± 145.44 68.127 ± 9.539b 371.745 ± 80.921b干细胞移植组③ 15 251.087 ± 13.083 1000.869 ± 172.360 48.907 ± 13.875 270.170 ± 84.676F值 8.370 3.541 7.201 6.044P值 0.001 0.039 0.002 0.005

三、旷场周边和中心区域活动状态结果

干细胞移植组和假手术组小鼠周边活动时间和距离明显长于手术组（F= 8.370，P= 0.001），而假手术组和干细胞移植组的小鼠周边活动时间和距离长短无差异(F= 3.541，P= 0.039)。干细胞移植组和假手术组小鼠中心活动时间及路程明显短与手术组(F= 7.201，P= 0.002)，干细胞移植组和假手术组小鼠中心活动的时间和距离比较无差异（F= 6.044，P= 0.005,表3）

讨 论

BMSCs作为一种有潜能的干细胞，可自我更新，自我复制，横向分化为神经细胞，且脑内移植后可促进内源性神经再生 ，因而广泛用于神经系统疾病的治疗。对于严重的脑缺血损伤以往以对证治疗以及康复、理疗等方法为主，但往往收效甚微。国内外已有大量的动物实验证明间充质干细胞对脑缺血动物的神经系统有很好的修复作用，并可以通过顺磁性氧化铁粒子（MPIO）标记间充质干细胞后给脑损伤的动物移植，脑室注射后第二天头颅MRI即可显示MPIO标记的间充质干细胞在病变部位出现，而静脉注射后一周可检测到移植的间充质干细胞迁移到病变部位，移植后120 d，病理检查发现不到10﹪的间充质干细胞分化为神经元和胶质细胞，而且病灶中心形态测量，发现动物脑白质量有增加[7-12]。以上实验充分证明间充质干细胞移植治疗脑缺血性损伤性疾病的可行性，同时也提示间充质干细胞移植治疗脑损伤不仅仅是可以转化为神经元和神经胶质细胞，更重要的是可以产生并通过旁分泌的形式释放多种细胞因子，促进损伤区域的修复。本研究采用结扎双侧颈总动脉制作脑缺血模型，脑缺血其特征性的表现：运动功能的损害，姿势的异常，智力及认知功能发育迟缓，故生物学行为检验是脑缺血动物模型检验中重要的手段[13]。转棒仪用于检测动物的运动协调性和疲劳性。大鼠在转棒上停留的时间长短，表示其运动协调能力可说明锥体外系、小脑及周围神经是否受到损伤。转棒实验中降落的潜伏期时间越长提示小鼠的协调性能越好，越不易疲劳，反之则越差。转棒实验分析发现，手术组小鼠转棒降落潜伏期明显低于假手术组，细胞移植组小鼠降落的潜伏期明显长于手术组小鼠的降落的潜伏期。提示手术组小鼠存在运动协调性下降和疲劳性增加；而细胞移植能够明显提高手术干预小鼠的运动协调性和疲劳性状态[14]。旷场试验可用于测试动物的活动量、活跃程度、探索行为及对新空旷环境的认知能力。通过观察新异环境中自主行为、探究行为和紧张度等，可反映鼠心理行为状态。常态小鼠喜欢群居和洞穴，在开放的环境中，小鼠习性是喜欢在周边区活动；旷场试验的场地对小鼠来说是非常宽广的新环境，对此开放的场所小鼠会产生焦虑，总路程和平均速度以及跨格次数被视为反映小鼠自发运动的主要数据[15-17]。本实验中3组小鼠在旷场实验运动运动总路程和跨格次数等自发运动数据显示无显著差异，但平均速度则差异显著。在周边运动时间和路程以及中心运动时间和路程上有明显差异，手术组小鼠明显存在中心活动时间及路程的增长较假手术组，说明脑缺血小鼠存在情绪的障碍以及认知功能障碍，而干细胞移植组小鼠周边活动时间和路程明显长于手术组而同假手术组无差异，提示干细胞移植可以纠正脑缺血小鼠的紧张焦虑的情绪异常，并增加对新环境的的认知能力，保持常态的周边活动的习性。本实验通过对小鼠运动行为学分析发现脑缺血损伤后小鼠的运动协调能力以及认知能力明显受损，骨髓间充质干细胞移植可明显改善脑缺血受损小鼠的运动协调能力及认知能力。为干细胞用于临床治疗提供理论基础。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on cerebral ischemia mice behavior

Wang Yali*,Chen Guojun,Wang JinFu,Cui YuHua,Fang Feng,Zhang Qing,Wang Di,Zhang Jing.*Zhejiang Armed Police Hospital,Jiaxing 314000,China

Wang JinFu:Email:wjfu@zju.edu.cn

Objective To examine the effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on behaviors of cerebral ischemia mice.Methods40 neonatal mice of 7-8 day old were randomly divided into sham group with only neck skin incision and no carotid artery ligation,surgery group with the ligation of bilateral common carotid artery and stem cell transplantation group with the ligation of bilateral common carotid artery.After 4 days,neonatal mice in the stem cell transplantation group were injected with 0.15ml of bone marrow mesenchymal stem cells (1×106cells) to the heart of neonatal mice.Neonatal mice in the sham group and surgery group received only an injection of 0.15ml saline.After 30 days mice were evaluated for the movement and behavioral functions with the ethology platform (bar-transferring meter and open-field test).Results(1) The time at which each animal fell from the drum was much longer in the stem cell transplantation group and the sham group than those in the surgery group ,and was not significantly different between the sham group and stem cell transplantation group (F=8.525，P= 0.001).(2) In the open field test,the grid-crossing frequency,the total distance and the average movement speed of mice between three groups were not significantly different (P> 0.05).(3) The time and distance of peripheral activity of mice in the stem cell transplantation group and the sham group were much longer than those of mice in the surgery group (F= 8.370，P= 0.001),and there was difference between the sham group and the stem cell transplantation group (F= 3.541，P= 0.039).(4) The time and distance of center activity of mice in the stem cell transplantation group and the sham group were much shorter than those of mice in the surgery group (F= 7.201，P= 0.002),and there was no difference between the sham group and the stem cell transplantation group (F= 6.044，P= 0.005).ConclusionThe transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells can significantly improve the movement,coordination skills and cognitive abilities of cerebral ischemia mice.

Bone mesenchymal stem cells；Brain ischemia；Mice；Motor activity

2013-10-24)

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.002

嘉兴重点科技创新团队基金（20121208）

31400 嘉兴，浙江武警总队医院（王亚莉、陈国军、方凤、崔玉华、张青、王迪、张静）；浙江大学生命科学学院（王金福）

王金福，Email：wjfu@zju.edu.cn

王亚莉,陈国军,王金福,等.骨髓间充质干细胞对脑缺血新生小鼠运动行为状态异常的疗效观察[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(2):84-88.