TLR4对胃癌细胞放射敏感性的影响探讨

吴进盛

（儋州市农垦那大医院肿瘤内科，儋州 571700）

放疗是治疗恶性肿瘤的主要临床手段，多数专家认为，肿瘤细胞对放射线产生耐受性是影响肿瘤放疗疗效的主要原因［1］，因此，提高肿瘤细胞放射敏感性是目前临床研究的热点。近几年大量文献报道［2］证 实，Toll样 受 体 4（Toll－like receptor 4，TLR4）和其他类型TLR在各种肿瘤组织中均有广泛表达，具有促进肿瘤发生、发展、增殖、凋亡、侵袭转移以及免疫逃逸等多方面生物学效应［3］，因此，肿瘤放疗敏感性可能与TLR4表达有紧密联系。本研究对小鼠胃癌细胞中TLR4表达与放射敏感性进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

将小鼠成纤维细胞株NIH3T3（上海研域生物科技有限公司）和小鼠胃癌细胞株MFC（上海研域生物科技有限公司）分别进行体外低糖DMEM完全培养液传代培养［4］和体外高糖RPIM－1640完全培养液传代培养［5］。取对数生长期 MFC细胞，分为脂多糖（LPS）组、瑞沙托维（TAK－242）组和空白对照组。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 LPS组MFC细胞照射前4h加入浓度为1μg／mL的 LPS（美国sigma公司）；TAK－242组照射前1h加入浓度为1μg／mL的TAK－242（上海研域生物科技有限公司）；空白对照组只加入磷酸缓冲液（PBS）。3组 MFC细胞及NIH3T3细胞均使用 X.S.S.205（FZ）型固定式 X射线深部治疗机进行5Gy照射和0Gy照射（以下均称假照）。照射条件：单次高剂量照射5Gy，源靶距56cm，剂量率0.387Gy／min［6］。

1.2.2 细胞生物学检测 采用流式细胞术（FCM）检测MFC细胞TLR4表达，TLR4试剂盒（上海研域生物科技有限公司）；CCK－8法检测MFC细胞增殖活性（日本同仁化学研究所上海代表处）；克隆形成实验检测细胞放射敏感性（anti－spindlin1／SPIN－2上海信裕生物科技有限公司）；FCM检测细胞凋亡和周期，细胞凋亡与周期检测试剂盒（上海研域生物科技有限公司）。

1.3 观察指标

观察NIH3T3细胞与MFC细胞经5GyX射线照射前后TLR4表达情况，并比较LPS和TAK－242对X射线照射前后MFC细胞增殖活性、放射敏感性、凋亡率和周期的影响。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤细胞经5GyX射线照射前后TLR4表达

NIH3T3细胞经5GyX射线照射24h后TLR4表达水平有所下降，但与假照比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；MFC细胞经5Gy X射线照射24h后TLR4表达水平显著下降，与假照比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 肿瘤细胞经5Gy X射线照射前后TLR4表达

2.2 LPS和TAK－242对X射线照射前后MFC细胞增殖活性、放射敏感性和凋亡率影响

MFC细胞经5Gy X射线照射后增殖活性、放射敏感性显著下降，凋亡率显著升高，与假照比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；假照条件下，MFC细胞经TLR4阻断剂TAK－242和激动剂LPS处理后增殖活性、放射敏感性和凋亡率发生显著升高或降低，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5Gy照射条件下，MFC细胞经TLR4阻断剂TAK－242处理后，增殖活性显著升高；经激动剂LPS处理后放射敏感性和凋亡率发生显著升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

2.3 LPS和TAK－242对X射线照射前后MFC细胞周期影响

MFC细胞经5Gy X射线照射后，G0／G1期和S期细胞显著下降，G2／M期细胞显著升高，与假照比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；假照条件下，MFC细胞经TLR4阻断剂TAK－242处理后，G0／G1期显著下降、G2／M期显著升高；经激动剂LPS处理后，S期显著升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表3）。

表2 LPS和TAK－242对X射线照射前后MFC细胞增殖活性、放射敏感性和凋亡率影响

表3 LPS和TAK－242对X射线照射前后MFC细胞周期影响

3 讨论

恶性肿瘤严重威胁人类健康，是临床治疗的一大难题。目前治疗恶性肿瘤的方法主要有手术、放疗和化疗，其中接受放疗的患者所占比例较高［7］。本研究选择小鼠胃癌细胞株MFC作为研究对象，通过与小鼠正常组织来源的成纤维细胞株NIH3T3进行比较，观察MFC细胞对TLR4的表达情况，并比较照射后MFC细胞增殖活性、放射敏感性、凋亡率和周期的变化以及激动剂LPS和阻滞剂TAK－242对MFC细胞放射敏感性的影响［8］。结果显示，与NIH3T3比较，MFC细胞经5Gy X射线照射24 h后TLR4表达水平下降，表明MFC受照后TLR4为低表达。

增殖活性是细胞生命活动的重要特征，是细胞活性的直观反应［9］。肿瘤细胞受到辐射后，细胞表面膜受体产生细胞保护性通路和毒性通路两种信号传导，前者参与细胞的抑制增殖，后者参与细胞的凋亡［10］。本研究中MFC细胞经5Gy X射线照射后增殖活性显著下降，表明MFC细胞经X射线照射后增殖活性被抑制。MFC细胞经激动剂LPS和阻滞剂TAK－242处理后，增殖活性显著上升或下降，表明激动剂LPS和阻滞剂TAK－242能够对MFC细胞增殖活性产生刺激或抑制效果。

细胞放射敏感性的检测方法为细胞克隆形成实验［11］，MFC细胞经5Gy X射线照射后存活分数显著下降，经激动剂LPS和阻滞剂TAK－242处理后显著上升或下降。另外，MFC细胞经5Gy X射线照射后凋亡率显著升高，经LPS和TAK－242处理后凋亡率显著上升或下降。结果表明，TLR4与肿瘤放射敏感性和凋亡率紧密相关。

肿瘤细胞周期的调节主要通过G1期阻滞实现［12］，M期后部分细胞转入G0期即处于阻滞，从而脱离细胞周期，暂时停止分裂；部分继续分裂完成周期循环［13］。X线照射可导致肿瘤细胞DNA损伤，从而引起细胞周期延迟，细胞受损后发生G1期和G2期阻滞，能够修复的细胞可进入下一周期，不能修复的细胞则被清除［14］。本研究中，MFC细胞经5Gy X射线照射后，G0／G1期显著下降，G2／M期显著升高，细胞周期发生较大改变。

总体来看，MFC细胞受5Gy X射线照射后增殖活性、放射敏感性、凋亡率和周期均产生显著改变，TLR4表达受到影响，而受到激动剂LPS和阻滞剂TAK－242刺激后，TLR4表达又发生显著升高或下降。由此可见，肿瘤细胞的TLR4表达与放射敏感性有紧密联系，且可受到激动剂和阻滞剂刺激后发生显著改变。

综上所述，TLR4可对MFC细胞放射敏感性产生较大影响，MFC细胞对TLR4的低表达主要受增殖活性、放射敏感性、凋亡率和细胞周期影响。

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