柴芩承气汤对急性胰腺炎大鼠肠道平滑肌细胞三磷酸肌醇的影响

王晓翔，林子琦，郭佳，张晓鑫，骆瑞杰，夏庆，薛平

（四川大学华西医院中西医结合科，成都 610041）

胃肠道是重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）病理生理过程中最早也是最易受损的器官之一，常表现为胃肠动力功能障碍，甚至发生肠麻痹［1］。胃肠动力功能障碍不仅与急性期全身炎性反应有关，还与后期感染密切相关［2］。因此，胃肠动力功能障碍被认为是SAP病情恶化的扳机点，但西医尚无行之有效的治疗措施。近年来，国内采用中西医结合治疗SAP取得很好疗效。柴芩承气汤（Chai－Qin－Cheng－Qi Decoction，CQCQD）是被华西医院大样本临床研究所证实的疗效确切的临床验方。前期研究［3］证实CQCQD可促进胃肠动力功能恢复，缩短器官衰竭的持续时间，降低后期感染发生率，但其具体作用机制尚不明确。

三磷酸肌醇 （inositol 1，4，5－triphosphate，IP3）作为细胞内重要的第二信使，作用于内质膜或液泡膜上的Ca2＋通道，促进钙库释放Ca2＋，液泡Ca2＋浓度升高，进而促进平滑肌细胞收缩［4，5］。CQCQD促进SAP胃肠动力功能的恢复是否与肠道平滑肌细胞IP3浓度的变化有关，目前尚无研究。

因此，本研究拟采用动物实验，研究CQCQD对精氨酸诱导的急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）大鼠模型肠道平滑肌细胞IP3浓度的影响，探讨CQCQD促进ANP胃肠动力功能恢复的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年Sprague－Dawley（SD）大鼠（scxk（川）2009－09）30只，3月龄，雌雄不拘，体质量250～300 g，四川大学华西医学中心实验动物中心提供。

1.2 CQCQD制剂

方剂的组成：柴胡15g、黄芩15g、厚朴15g、枳实15g、茵陈15g、栀子20g、生大黄20g（后下）、芒硝20g（冲服）。将中药用清水500mL浸泡1h，再用煎药机煎0.5h，煎成200mL／剂。由四川大学基础医学院生化测试中心－70℃制作成冻干粉。实验前用注射用水按2.4g生药／mL配制备用。采用相同容积的生理盐水做安慰剂。

1.3 仪器

主要仪器设备：Maxi－MixII试管震荡器（美国Barnstead／Thermolyne）；超净工作台（成都芯锐通风空调净化设备有限公司）；水平电泳仪（美国BIORAD公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss 510duo）；PT－3502酶标分析仪 （北京普通新桥技术有限公司）。

1.4 主要试剂

高糖 DMEM（GIBCO 公 司）；胶原酶 P（ROCHE公司）；精氨酸（美国Sigma公司）；大豆酶抑制剂（美国Promega公司）；L多聚赖氨酸（北京博润莱特科技公司）；Flu3－AM（Beyotime）；Pluronic F－127（上海世泽生物科技）；ELISA mouse F Inosito1 1.4.5－Triphosphate，ELISA mouse F phospholipase C及ELISA mouse F protein kinase C均从美国GBD公司购得；其他试剂如未做特殊说明均购至Sigma公司。

1.5 动物模型的制作

造模方法如文献［8味五参四苓汤联合逐饮散配合顺铂胸］所述，大鼠适应性喂养7d，实验前禁食12h，不禁水。将每只大鼠称重，并做好标记。固定大鼠，艾力克消毒，沿腹壁45°进针，将8%L－精氨酸按照5mL／100g计算剂量注入腹腔，1h后相同剂量再注射1次，72h后造模成功；对照组采用生理盐水代替精氨酸，剂量及给药方法与ANP模型相同。

1.6 分组及标本收集

将健康30只SD大鼠随机分成对照组、ANP组及CQCQD组，每组10只。对照组：采用假模型大鼠，适应性喂养72h后，经胃管注入生理盐水1 mL／100g，1次／2h；ANP组：采用ANP模型大鼠，经胃管注入生理盐水 1mL／100g，1 次／2h；CQCQD组：采用ANP模型大鼠，经胃管注入中药1mL／100g，1次／2h。第6小时取血，分离血清，检测血清胆囊收缩素－8（CCK－8），乙酰胆碱（Ach）及5－羟基色氨酸（5－HTP）；取胰腺组织做病理检查；取肛门上2cm处肠道约10cm分离肠道平滑肌细胞，检测细胞内IP3及细胞内钙离子浓度（［Ca2＋］i）。

1.7 肠道平滑肌细胞分离

处死大鼠后，距离肛门2cm处，取肠道约10 cm，生理盐水反复冲洗肠道组织，用手术刀轻轻刮去黏膜层和浆膜层；将肠道组织放入已消毒的小玻璃瓶中，剪碎，用移液管吸入消化酶液约5mL，将剪碎的组织与消化酶液一起吸入圆底离心管，放入水育摇床中，31℃，消化20min；取出用吹打管反复轻轻吹打后，再次用移液管吸入消化酶液约5mL，加入离心管中，继续放入水育摇床中，31℃，消化20 min；加入终止液约20mL，混匀，反复轻轻吹打后，过细胞筛，离心，800r／min，4min，收集细胞；用DMEM培养液重悬细胞。用0.4%台盼蓝液染色，在3min内确认细胞活力＞90%。

1.8 肠道平滑肌细胞［Ca2＋］i检测

参照既往检测胰腺腺泡［Ca2＋］i的方法［6］，具体按如下步骤进行：1）经0.1g／L多聚赖氨酸37℃过夜浸泡的培养板和盖玻片用三蒸水冲洗3遍，晾干备用。使用前用紫外线照射15min。2）新鲜分离成功的肠道平滑肌细胞置入培养板内，在5%CO2，37℃的孵箱中，孵育6h。3）细胞贴壁后，吸尽培养板内上清液，再向各孔中加入5μmol／L Flu－3－AM 及0.01%Pluronic F－127的 Hepes缓冲液，避光，于5%CO2孵箱中37℃孵育30min。4）洗净各控荧光染料（用Hepes缓冲液反复冲洗3次），加入Hepes缓冲液0.5mL。5）在共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）下，采用激发波长488nm／560nm观测。每个标本随机选取视野内20个不同细胞，通过LSCM所附带的荧光定量分析软件对所选定区域进行荧光强度（fluorescent intensity，FI）的定量分析，［Ca2＋］i用FI表示。（注：每个标本观测时间控制在5min内，室温定为20～25℃）

1.9 血清CCK－8、Ach及平滑肌细胞IP3的检测

血清CCK－8、Ach及平滑肌细胞IP3均采用酶联免疫吸附剂 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定。具体操作步骤按试剂盒说明进行。

1.10 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组资料比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胰腺组织病理评分

ANP组胰腺病理评分（7±1.1）与对照组相比较（1±0.3），差异有统计学意义（P＜0.01）；CQCQD组病理评分（4±0.7）与ANP组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 血清CCK－8、Ach及5－HTP比较

CQCQD组血清 CCK－8浓度（31.5±6.2）ng／mL低于对照组（44.0±8.1）ng／mL及 ANP组（46.0±7.6）ng／mL（P＜0.05）；ANP组血清 Ach浓度（236.1±23.6）ng／mL与对照组（310.0±26.1）ng／mL和 CQCQD组（298.5±24.7）ng／mL相比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但CQCQD组与对照组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3组血清5－HTP相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

表1 各组血清CCK－8，Ach and 5－HTP水平（±s）

表1 各组血清CCK－8，Ach and 5－HTP水平（±s）

与对照组及ANP组相比，aP＜0.05；与对照组及CQCQD组相比，b P＜0.05

组别 CCK－8／（ng／mL） Ach／（ng／mL） 5－HTP／（ng／mL）对照组44.0±8.1 310.0±26.1 15.5±6.1 ANP组 46.0±7.6 236.1±23.6b 14.3±5.4 CQCQD组 31.5±6.2a 298.5±24.7 14.5±7.4

2.3 肠道平滑肌细胞IP3及［Ca2＋］i比较

ANP组肠道平滑肌细胞IP3（16.3±1.1）pg／mL及［Ca2＋］i（108.0 ±15.5）与对照组IP3（21.9±1.3）pg／mL 及 ［Ca2＋］i（141.2 ± 20.2）和CQCQD组肠道平滑肌细胞IP3（21.6±1.7）pg／mL及［Ca2＋］i（138.8±16.3）相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；但CQCQD组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

表2 各组肠道平滑肌细胞IP3及［Ca2＋］i水平（±s）

表2 各组肠道平滑肌细胞IP3及［Ca2＋］i水平（±s）

与对照组及CQCQD组比较，aP＜0.05

组别 IP3／（pg／mL） ［Ca2＋］i／（FI）对照组21.9±1.3 141.2±20.2 ANP组 16.3±1.1a108.0±15.5a CQCQD组21.6±1.7 138.8±16.3

3 讨论

胃肠动力功能障碍是SAP病情恶化的扳机点，与急性期器官衰竭及后期感染密切相关。及时恢复胃肠动力可进一步降低SAP患者病死率，已是国内外学者的共识。但是，目前对SAP患者急性期胃肠动力障碍发生的具体机制尚未完全明了，西医亦无行之有效的治疗措施，而中医药则发挥出了独到优势，疗效已得到国内学者的公认［9］。

现代中医认为：SAP急性期常常表现为阳明腑实证，肠源内毒素血症是阳明腑实证病理生理过程中发生热、惊、厥、闭、脱及脏器衰竭的主要原因，被认为是阳明腑实证之主要病理生理基础。因此，促进肠道动力功能的恢复，减少肠源性内毒素吸收入血，是中医治疗SAP的关键。近年来，国内采用大承气汤类复方汤剂为主的通里攻下法治疗SAP已在临床普遍应用，并取得了较好疗效。动物实验发现：大承气汤可升高血清胃动素（motilin，MTL）水平，促进胃肠运动功能的恢复。目前，国内研究较多的大承气汤类汤剂有：清胰汤、CQCQD及柴芍承气汤［3，10，11］。其中，CQCQD 是被四川大学华西医院大样本临床研究所证实治疗急性期SAP疗效确切的临床验方，由大承气汤加柴胡、黄芩，茵陈及栀子组成。大量基础与临床研究［6］证实，CQCQD可通过减轻胰腺腺泡细胞钙超载，减少SAP急性期炎性介质释放等多环节、多靶点作用，发挥治疗SAP的疗效。在促进SAP胃肠动力恢复方面，前期研究［5］已经发现：CQCQD可促进SAP胃肠动力功能恢复，降低血清内毒素水平，减轻SAP患者急性期炎性反应，减少多器官功能不全发生率，缩短器官功能障碍的持续时间，降低病死率。因此，对其促SAP胃肠动力恢复机制的深入研究，有助于进一步提高SAP疗效。但是，在促进SAP胃肠动力恢复方面，针对以上诸方的研究几乎都集中在MTL、CCK、Ach及血管活性肽（vasoactive peptide，VIP）等胃肠激素的层面［7］，未对肠道动力的基本单元——肠道平滑肌细胞进行研究。

已有研究［12］证实：Ach可通过 M2受体，激活胃肠平滑肌的Gi蛋白，直接抑制腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）活性，使其产物cAMP水平下降，引起Ca2＋内流，促进平滑肌收缩；同时，细胞内IP3水平下降可直接抑制细胞内钙库释放钙离子［13］。本实验直接以肠道平滑肌细胞为研究对象，探讨CQCQD对肠道平滑肌细胞PLC信号传导通路及其最关键的第二信使IP3［4］的影响。研究结果发现：ANP大鼠血清CCK－8及5－HTP与对照组无明显变化（P＞0.05），但ANP大鼠血清Ach水平与对照组相比明显降低（P＜0.05），同时平滑肌细胞内IP3水平及［Ca2＋］i水平较对照组也明显降低（P＜0.05），这说明SAP胃肠动力功能障碍的发生可能与血清Ach水平降低、平滑肌细胞IP3介导的PLC信号传导障碍有关。本研究同时发现：CQCQD干预后，血清Ach水平较ANP组升高（P＜0.05），平滑肌细胞内IP3及［Ca2＋］i也升高（P＜0.05），这说明CQCQD促进肠道动力功能的恢复可能与Ach升高、平滑肌细胞IP3浓度升高、促进钙库释放［Ca2＋］i，进而促进肠道平滑肌收缩有关。

综上所述，SAP胃肠动力功能障碍的发生与血清Ach及肠道平滑肌细胞内IP3水平降低、细胞内钙库释放钙离子减少有关。CQCQD促进ANP大鼠胃肠动力恢复可能与升高ANP大鼠血清Ach水平及平滑肌细胞IP3浓度，进而促进钙库释放［Ca2＋］i有关。但是SAP胃肠动力功能障碍中IP3的上游及下游机制尚不清楚；CQCQD作为复方汤剂，是否还作用于IP3通路之外的其他信号通路，促进SAP胃肠动力障碍的作用尚不确定；且CQCQD组成成分较为复杂，具体发挥作用的有效成分也不清楚，还需进一步研究。

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