CD147、VEGF在骨巨细胞瘤中的表达及临床研究

米宁，刘婕

（1.遂宁市中心医院骨科，遂宁 629000；2.遂宁市中心医院肿瘤科，遂宁 629000）

骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone，GCT）是一种具有潜在侵袭性及恶变性的良性原发性肿瘤，在骨原发性肿瘤中约占3%～6%，骨良性肿瘤中约占17%。GCT主要发生于20～40岁，多为女性，统计资料［1］显示我国GCT发病率高于西方国家。GCT病变主要位于骨骺，如果病变较大则可扩展至干骺端甚至骨干。常见发病部位包括股骨远端、桡骨远端、胫骨近端、肱骨近端和骶骨等。统计资料显示GCT患者约80%为良性，25%～50%患者经过治疗后复发，少数发生肺转移，极少数在放疗或复发后恶变。目前临床上最常用Jaffe、Enennecking和Campanacci外科分期法，影像学分型和病理学分级均不能准确预测GCT的生物行为，也不能准确评估预后情况，由此需要探寻一种影响GCT生物行为以及预后的相关检测指标［2］。本研究分析细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinases inducer，CD147）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在GCT组织中的表达情况及与临床病理和预后的相关性，旨在为临床判断GCT生物学行为以及评估其预后提供准确的参考指标，为临床治疗提供一种新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

所选68个标本来源于骨科2008年4月～2013年4月收治的GCT患者，其中男29例，女39例；年龄13～56岁，平均（33.5±4.7）岁，均行手术治疗，其中8例单纯刮除，24例刮除＋植骨，20例切除＋植骨，16例切除＋人工关节置换。取材部位包括脊柱6例、尺骨2例、桡骨5例、股骨23例、胫骨10例、骶骨10例、髂骨5例、指骨7例。选取标本均经病理组织学证实为GCT并参照Jaffe外科分级标准［3］：Ⅰ级25例，Ⅱ级34例，Ⅲ级9例。标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片机4μm连续切片，常规苏木素－伊红（HE）染色。

1.2 主要试剂、设备

1.2.1 试剂 免疫组化染色试剂盒，浓缩型DAB试剂盒，抗原修复液，兔抗人 CD147、MMP－2、MMP－9、VEGF多克隆抗体，PBS，苏木精。

1.2.2 设备AMERITOOL公司切片机、OLYMPUS公司显微镜、LEICA 相机、EPPENDORF离心机、GILSON移液枪、国产水浴箱、SIEMENS 4℃冰箱。

1.3 S－P染色方法

1）石蜡包埋后，4μm连续切片，常规脱蜡置水。2）抗原修复，每张切片处理3次，2min／次。3）PBS冲洗3次，5min／次，于室温下3%H2O2处理15 min彻底灭活内源性过氧化物酶。4）PBS冲洗3次，5min／次，于室温下滴加5%山羊血清封闭液，保持30min，将多余液体除去。5）加入一抗，CD147（1∶100）、MMP－2（1∶100）、MMP－9（1∶150）、VEGF（1∶100），将其置于4℃冰箱中过夜。6）37℃下孵育1h。7）PBS冲洗，每张切片处理3次，5min／次，加入通用的二抗后处理30min。8）PBS冲洗，每张切片处理3次，5min／次，加入辣根酶标记链霉卵白素液后处理30min。9）PBS冲洗，每张切片处理3次，5min／次，DAB试剂显色，显微镜下观察，5～15min后水洗并终止显色反应。10）苏木精复染、脱水、透明、封片。

1.4 计数方法

GCT内任一孤立棕黄色细胞或者细胞簇均视为一条单独的血管，有无管腔及红细胞并不作为将其判定为血管的必要条件，已经形成的肌层血管、分辨不清、染色模糊的细胞不计，低倍镜下找到内含微血管最为丰富的肿瘤组织即“热点”，高倍镜下计数3个视野内的微血管数目，取其平均值分析。

1.5 染色判定标准

高倍镜下观察每张切片，选取5个不同视野，观察阳性细胞的数量及其染色情况，阳性细胞为胞浆或胞膜浅黄色或棕黄色，综合阳性细胞数量及染色强度进行分级［4］。阳性细胞所占百分比分级评分标准：1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（＞75%）；染色程度分级评分标准：0分（无色）、1分（浅黄色）、2分（黄色）、3分（棕黄色）。上述阳性细胞所占百分比分级评分乘以染色程度分级评分后分为4个等级：0～1分为（－）、2～3分（＋）、4～5分（＋＋）、＞6分（＋＋＋）（见表1）。

表1 S－P计分标准（分）

1.6 统计学方法

选用SPSS18.0软件包对数据进行分析，CD147、VEGF、MMP－9与患者性别、年龄、分级、预后之间的关系采用非参数秩和检验，CD147与VEGF、MMP－9、MMP－2 表达的相关性采用Spearman分析，检验标准为α＝0.05，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理分析

CD147于GCT组织中染色强度不一，单核基质细胞的胞浆内和包膜上主要表达呈棕黄色颗粒状的阳性物质，多核巨细胞也会存在少量的表达。MMP－2、MMP－9主要表达于多核巨细胞，呈现胞浆着色，棕黄色为阳性物质，在部分单核基质细胞中也有一定的表达。VEGF在细胞质内、多核和单核细胞内均有阳性表达。

2.2 CD147、VEGF阳性表达和临床病理参数关系分析

患者性别、年龄与CD147、VEGF阳性表达无相关（见表2）；各级Jaffe患者CD147与 MMP－2阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），预后各分组CD147、MMP－2、MMP－9阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）（见表3）。

表2 CD147、VEGF阳性表达和年龄、性别的关系（n）

表3 Jaffe分级和预后与CD147、VEGF阳性表达的关系

2.3 CD147与VEGF阳性表达相关性分析

通过Spearman相关性分析，CD147的表达和MMP－9的表达呈正相关（R＝0.273，P＝0.025），CD147的表达和VEGF表达呈正相关（R＝0.417，P＜0.001），提示CD147与VEGF等表达之间存在密切联系，其可能影响或者调控其他因子的表达。

3 讨论

GCT是一种较为常见的骨原发性良性肿瘤，具有一定的恶变性，目前已明确其细胞组分，主要包括单核细胞样细胞、单核基质细胞、多核巨细胞，但上述细胞的起源和在肿瘤发生发展过程中的相关作用还需进一步研究，另外GCT发生发展涉及的众多细胞因子以及信号通路的相关作用机制也尚未阐明。临床上治疗GCT首选手术治疗，但患者在术后仍存在复发以及恶变的危险性［5］。

CD147是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，其为多效性分子，在胎儿的发育以及视网膜功能方面起着至关重要的作用，同时对于胸腺T细胞的发展过程也具有一定作用，与淋巴细胞应答程序、组织重建、空间认知和精子发生等也有着密切关系［6］。CD147在肿瘤的发生发展及侵袭转移过程中发挥着重要作用：1）促进肿瘤的侵袭和转移；2）诱导肿瘤血管的生成；3）促进肿瘤细胞锚着非依赖性生长。临床研究已经在众多的肿瘤组织如神经胶质瘤、成釉细胞癌、结直肠癌、黑色素瘤、肺癌中发现了CD147表达，在肿瘤的发展过程中刺激并诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的生成，主要通过直接诱导成纤维细胞和内皮细胞两种途径来实现。近年来研究［7］发现其还可能直接诱导肿瘤细胞本身而产生MMPs。

CD147可通过诱导VEGF来调控血管的生成，此为CD147调控肿瘤发展并表达转移潜力的另一方面作用。VEGF在大多情况下主要调节血管生成过程，其中也包括肿瘤形成过程。体内外临床研究显示，CD147的表达和VEGF的诱导关系密切。CD147过度表达时可刺激肿瘤的生长及血管的生成，此过程会因CD147表达的抑制而抑制。CD147的功能和附着糖的类型与肿瘤存在直接关系，可推测细胞外基质可能在CD147糖基化过程中发挥着重要作用，同时考虑到MMPs的表达诱导也需要糖基化，提示糖基化过程可能为调控CD147的重要机制，可作为今后治疗方向进行研究［8］。

近年来临床研究证实肿瘤的组织学表现和生物学行为之间存在不一致性，Jaffe分级以及Enneking影像学分级虽具有判定GCT局部浸润的作用，但无法预测其复发和转移的关系。本研究结果显示：患者的性别、年龄和CD147、VEGF阳性表达无相关，差异无统计学意义（P＞0.05），因此患者年龄、性别不能作为判断GCT侵袭以及复发的指标。各级Jaffe患者CD147与MMP－2阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），预后各分组CD147、MMP－2、MMP－9阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），提示CD147与MMPs、GCT侵袭和预后相关，可作为临床评估GCT预后的重要参考指标。CD147与VEGF、MMP－9等因子表达呈正相关，提示CD147可能促进VEGF的表达，并通过细胞外基质和促进肿瘤血管生成来为肿瘤的增殖以及转移提供有利条件。

综上所述，CD147的阳性表达与GCT患者病情恶化及复发有着密切关系，并且和 MMP－9、VEGF的阳性表达密切相关，是目前临床上评价GCT恶性程度以及评估预后的重要检测指标；也可作为化疗新靶点，为临床诊断和治疗提供新的思路。

［1］于飞，刘晓晴.PDGF－C在肿瘤生长及肿瘤抗VEGF治疗耐药中的作用［J］.肿瘤预防与治疗，2013，26（1）：33－37.

［2］韩跃虎，杨柳，黄景辉，等.CD147、PCNA、VEGF和 MMPs在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义［J］.中国骨与关节外科，2012，5（1）：65－71.

［3］韩跃虎.CD147、PCNA、VEGF和 MMPs在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义［D］.西安：第四军医大学，2012.

［4］毕乃贵，王民，王莹.CD147在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义［J］.现代肿瘤医学，2007，15（12）：1846－1848.

［5］廖通权.CD147／EMMPRIN对体外破骨细胞分化成熟及活化影响的实验研究［D］.重庆：第三军医大学，2011.

［6］柳忠兴.CD147和Survivin在骨巨细胞瘤中的表达及其临床意义［D］.泰安：泰山医学院，2010.

［7］兰杰，刘晓光，韦峰，等.骨巨细胞瘤生物学特性研究进展［J］.中华外科杂志，2012，50（5）：468－470.

［8］柳忠兴，于秀淳.CD147和Survivin在骨巨细胞瘤中的表达及其临床意义［J］.中国骨与关节杂志，2012，1（3）：253－257.