人参皂甙20（R）－Rg3对人胶质瘤U87细胞凋亡的影响

柳云恩，刘欣伟，施琳，张玉彪，徐婷婷，高燕，侯明晓＊

（1.沈阳军区总医院急诊医学部，全军重症（战）创伤救治中心实验室，沈阳 110840；2.沈阳军区总医院骨科，全军重症（战）创伤救治中心，沈阳 110840）

胶质瘤在神经系统肿瘤中高居首位，其术后极易复发，化疗药物因耐药性及血脑屏障的限制，治疗效果受到很大制约［1］。人参皂甙Rg3是一种人参二醇类四环三萜皂苷，根据其第20位碳的构型可分20（R）与20（S）－人参皂甙 Rg3，尽管两者互为同型异构体，但功能却不尽相同。Sin等［2］发现20（S）－人参皂甙Rg3通过Akt和p53／p21依赖性信号传导途径，使人胶质瘤细胞生长停滞。20（R）－人参皂甙Rg3研究历史较短，但其具有抑制肿瘤生长、抗肿瘤转移和浸润、提高机体免疫力等作用，将可以作为肿瘤治疗中的一种重要方法。人参皂甙20（R）－Rg3对人胶质瘤U87凋亡的影响及机制尚不清楚。本研究旨在研究不同浓度Rg3对人胶质瘤U87细胞凋亡的影响，并深入探讨凋亡发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞培养 人胶质瘤细胞株U87购自中国科学院上海细胞研究所，细胞培养采用10%小牛血清的高糖DMEM培养液（Corning公司）。细胞在37℃，5%CO2饱和湿度下传代，取用对数生长期的细胞进行研究。

1.1.2 药物 人参皂甙Rg3由大连富生生物技术公司惠赠，纯度99.69%，用二甲基亚砜（DMSO）助溶，然后用RPMI1640细胞培养液稀释成以下6个浓度：200、100、50、25、12.5和6.25μg／mL，－20℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 四唑盐（MTT）比色法 对数生长期细胞经0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104／mL，每孔200μL细胞悬液于96孔培养板内，在37℃，5%CO2饱和湿度孵育箱内过夜，取出培养板，弃取旧培养液，分别加入不同浓度的Rg3（200、100、50、25、12.5和6.25μg／mL）和相应浓度的辅料 （50、25、12.5、6.25、3.125 和 1.563mg／mL），200μL／孔，空白对照组加入DMEM 培养液200μL，每组设4个平行孔，分别于24h，48h及72h取出96孔板，每孔加入 MTT（5mg／mL）20μL，培养箱内继续培养4h后，在倒置显微镜下观察细胞内MTT与线粒体酶反应后生成的蓝紫色结晶物，弃上清液，每孔加DMSO 150μL，室温震荡10min，用酶标仪检测570nm波长处的吸光度（A）值，实验共重复3次。按下列公式计算细胞生长抑制率（100%）＝（1－加药孔平均A值／对照孔平均A值）×100%。

1.2.2 AO／EB双荧光染色法 取对数生长期细胞接种于6孔板内，加入不同剂量Rg3，各孔终浓度分别为0、12.5、25和50μg／mL，24h后用0.25%胰酶消化细胞，用PBS液洗涤，使其终体积为20 μL，加入AO／EB染液1μL。在荧光显微镜下观察涂片细胞的凋亡，选取3个不同视野，计算细胞凋亡率，每组设3个平行孔。凋亡率（%）＝（早期凋亡细胞＋晚期凋亡细胞）／总细胞数×100%。

1.2.3 AnnexinV／PI双染法 取对数生长期细胞接种于6孔板内，加入不同剂量Rg3，使各孔终浓度分别为0、12.5、25和50μg／mL。制成单细胞悬液经PBS液洗涤两次后，加入AnnexinV 10μL，避光孵育30min，离心收集细胞。将细胞再次重悬后加入PI 5μL。采用流式细胞仪检测混合液细胞的凋亡状况。正常细胞：AnnexinV／PI（－）；早期凋亡：AnnexinV（＋）、AnnexinPI（－）；晚期凋亡细胞或坏死细胞：AnnexinV／PI（＋）。

1.2.4 Western Blotting蛋白印迹 提取对数生长期细胞的蛋白，每孔加入20μL，经SDS－PAGE电泳后，转膜2h，将转膜后的硝酸纤维素膜置入TBST缓冲液中漂洗后，把膜放入稀释的一抗中［PAkt（ser473）兔多抗（1∶1 000）、Akt兔多抗（1∶1 000）、Bcl－2鼠单抗（1∶100）、Bax鼠单抗（1∶200）、β－actin兔多抗（1∶500）］，温和震荡3h后置于4℃冰箱中过夜。回收一抗在TBST液中洗膜30min，把膜置入相应稀释的二抗中。取ECL试剂A和试剂B各0.5mL，混合后覆盖硝酸纤维素膜上，在暗室内同时放入X光胶片并作为方向标记，用底片扫描仪扫描X光，通过凝胶成像系统读取目的电泳带的密度扫描值，应用Quantity One软件定量分析目的条带与Actin的灰度值并计算比值。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂甙20（R）－Rg3对U87细胞生长的影响

与人参皂甙20（R）－Rg3 6.25μg／mL组相比，其他浓度组人参皂甙20（R）－Rg3在同一作用时间内均对人胶质瘤U87细胞产生抑制作用，差异均有统计学意义（P＝0.03）。人参皂甙20（R）－Rg3对肿瘤细胞的抑制效果有时间依赖性，与24h相比，48h及72h组20（R）－Rg3对肿瘤的抑制效果差异有统计学意义（P＝0.04）（见表1）。

2.2 AO／EB双荧光染色法检测Rg3对U87细胞凋亡的影响

人参皂甙20（R）－Rg3 25μg／mL作用于 U87细胞，可导致细胞发生不同的形态改变（见图1）。随着Rg3浓度越高，肿瘤细胞发生早期凋亡和晚期凋亡的比例逐渐增高，凋亡细胞与正常细胞比例几乎接近1∶1。

表1 人参皂甙20（R）－Rg3对U87细胞生长的抑制率 （n＝4，%）

图1 U87细胞AO／EB双荧光下凋亡的形态学表现

2.3 Rg3对U87细胞中Bcl－2家族凋亡及侵袭蛋白影响

经不同浓度人参皂甙20（R）－Rg3作用于U87细胞72h后，实验发现Rg3可以显著降低肿瘤细胞U87中抑凋亡蛋白Bcl－2表达水平，升高促凋亡蛋白Bax的表达。随着Rg3浓度的增加，U87细胞中Bax／Bcl－2比值呈浓度依赖性增加（见图2）。

图2 Rg3对U87细胞中Bcl－2、Bax表达的影响

2.4 Rg3对U87细胞中PI3k／Akt信号通路的影响

经不同浓度人参皂甙20（R）－Rg3作用于U87细胞72h后，Western Blot蛋白印迹结果显示，Rg3显著降低肿瘤细胞磷酸化蛋白p－Akt（Ser473）的表达，而并未影响t－Akt蛋白的表达（图4）。

图3 Rg3对U87细胞中PI3K／Akt信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

本研究发现6.25μg／mL人参皂甙20（R）－Rg3作用于人胶质瘤U87细胞24h后，可抑制肿瘤细胞的生长，随时间的延长抑制效果显著，而高浓度的Rg3（200μg／mL）对肿瘤细胞的生长抑制率可达97%以上，抑制呈时间－剂量依赖性。本研究采用形态学观察和流式细胞仪检测两种手段对Rg3处理的U87细胞进行观察，发现经人参皂甙20（R）－Rg3处理过的U87细胞体积缩小、核固缩，染色质凝集，部分染色质断裂成小块等典型的凋亡细胞表现。凋亡细胞数量随Rg3浓度增高而明显增多，流式细胞检测结果发现在Rg3处理24h后，肿瘤细胞凋亡比例明显增加。结果提示人参皂甙20（R）－Rg3通过促进细胞凋亡，抑制胶质瘤U87细胞的生长。

细胞凋亡受控于一个异常复杂的网络调控系统，PI3K／Akt信号传导是调节细胞凋亡的一个重要通路［3］，胃癌、乳腺癌、肾癌及多种肿瘤均存在PI3K／Akt通路的异常活化。近年来，研究［4］发现70%的胶质瘤也存在PI3K／Akt信号通路的活化，Akt是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，位于PI3K／Akt信号传导通路的核心部位。活化的Akt在介导细胞生长和增殖、细胞凋亡和抵制放化疗方面发挥重要作用［5］。本研究提示人参皂甙20（R）－Rg3能显著降低U87细胞p－Akt蛋白的表达，而对t－Akt蛋白几乎无任何影响。结果提示人参皂甙20（R）－Rg3可能是通过抑制人胶质瘤细胞Akt的活化，抑制肿瘤细胞的生长。有研究［6］发现Bcl－2家族可能是PI3K／Akt通路下游的重要介导者，Akt能负性调节促凋亡的Bcl－2家族成员。Bcl－2家族分为抑制凋亡和促进凋亡蛋白两类，促凋亡因子如Bad、Bax和Bak等，抗凋亡因子如Bcl－2和 Bcl－xL。其中Bax和Bcl－2在凋亡发生过程中发挥重要作用［7］。Bax和 Bcl－2具有拮抗性，它们可以以同源或异源二聚体形式存在，Bcl－2增加时，Bcl－2／Bax比值增加，细胞则趋于存活，反之细胞则趋向死亡，一般认为Bcl－2／Bax比值决定细胞是否凋亡［8］。通常情况下，Bcl－2基因主要分布在机体永久性细胞、增殖旺盛细胞，而在正常神经组织和胶质细胞中Bcl－2基因不表达。在胶质细胞反应性增生及胶质细胞瘤组织则常伴随Bcl－2表达［9］，肿瘤的恶性程度越高，Bcl－2基因表达越强［10］。Bcl－2基因表达强度与凋亡细胞密度成显著负相关。研究［11］认为肿瘤细胞中Bax蛋白表达与胶质瘤患者的生存率密切相关。本研究采用Western Blot技术定量分析了人参皂甙20（R）－Rg3对 U87细胞中Bcl－2及Bax蛋白表达的影响，结果发现Rg3能显著降低U87细胞中Bcl－2蛋白的表达，而升高Bax蛋白的表达，同时Bcl－2／Bax比值随着Rg3浓度的升高而增大。研究［12］发现人参皂苷 Rg3与 Bcl－2和Bcl－xL有很高的结合力。Park等［13］研究发现人参皂苷Rg3可以刺激肝细胞线粒体细胞色素酶释放，激活caspase－3和Bax蛋白，抑制Bcl－2蛋白表达，通过直接激活线粒体途径诱导肝细胞凋亡，与本研究结果相似。上述结果提示人参皂甙20（R）－Rg3通过改变Bcl－2及Bax蛋白表达，实现对人胶质瘤U87细胞的凋亡调控。

总之，本研究发现Rg3可能通过抑制PI3K／Akt信号转导通路中的Akt的磷酸化，降低肿瘤细胞抗凋亡蛋白Bcl－2表达，而调高促凋亡蛋白Bax的表达，进而调控人胶质瘤U87细胞的凋亡。

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