微波辅助提取栀子皂甙的工艺优化及其抗氧化性

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(温州大学生命与环境科学学院,浙江温州 325027)

栀子是茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实,作为中国传统的中药药材,在临床中被应用于保肝利胆药,历代本草经中亦有记载其效用。栀子性味苦寒,入心、肺、三焦经,具有清热泻火、利湿除烦、凉血解毒和抗氧化等功用[1-2]。栀子中含有多种化学成分,主要包括单萜、三萜(栀子花酸类)、黄酮(栀子素类)、环烯醚萜类(栀子甙类)、藏红花素、有机酸及挥发油等等。其中栀子皂甙为栀子的主要活性物质之一,具有消炎、镇痛、泻下、保肝、解热等作用,在医学上可用作抑菌剂、清热解毒剂等,广泛运用于医药研究、病理试验等方面,有很高的药用价值[3]。

目前，国内外皂甙的提取方法有很多,如乙醇提取法、水提取法和树脂吸附法等[4],但这些方法存在流程长、浪费率高以及提取率低等问题;吴亚超等[5]利用超声波辅助提取栀子皂甙,提取栀子苷含量较药典法高3.98%;王建辉等[6]将微波辅助萃取法应用于丝兰皂甙乙醇浸提中,时间缩短80%,提取率提高41.56%;贺晓龙等[7]总结了微波辅助提取百合总皂甙的优点,即萃取效率高、提取时间短、设备简单、溶剂消耗低和污染小等,但是都没有系统阐述微波辅助提取皂甙参数模型和最佳的提取条件。本试验综合文献资料,采用微波辅助的方法来提取栀子皂甙,以单因素实验(微波功率、微波时间、浸提时间、浸提温度、液固比、乙醇浓度)为基础,选出影响栀子皂甙得率最大的四个因素作为考察对象,采用了Box-behnken响应面法分析栀子皂甙提取的最优条件,提取的栀子皂甙与抗坏血酸作对比,探究栀子皂甙的抗氧化能力,旨在为开拓具抗氧化能力的天然皂甙提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

栀子果实 购于温州农贸市场,120 ℃烘干机器粉碎过后过50目筛,得栀子粉末;薯蓣皂甙标准品 纯度>98%,上海永叶生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 纯度>98%,美国Sigma 公司;抗坏血酸 分析纯,广州万从化工有限公司;乙醇、三氯甲烷、冰醋酸、高氯酸、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、磷酸二氢钠 均为国产分析纯。

HH-S型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;80-2型台式低速离心机 金坛市顺华仪器有限公司;UV-722型可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;NJL07-3型实验专用微波炉 南京杰全微波设备有限公司;TG-328A型分析天平 上海试验仪器厂;SHZ-Ⅲ型台式循环水式真空泵 上海英化仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 栀子皂甙的提取 根据文献[8]准确称取栀子粉末1.00 g,按一定的比例溶于一定浓度的乙醇溶液中,在一定的微波功率下处理一定时间,在一定温度下,浸提一定时间后,过滤得到的清液,用盐酸调pH至1～2、静置过滤得沉淀物,再用NaOH溶液调至溶解后,加入95%乙醇搅拌过滤,最后再次用盐酸调pH至1～2,过滤得栀子皂甙结晶。

1.2.2 单因素实验设计 固定乙醇浓度80%(V/V),微波功率450 W,微波时间40 s,浸提时间5 min和浸提温度20 ℃,分别设置液固比为5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 (mL/g),考察固液比对栀子皂苷得率的影响;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇浓度80%(V/V),微波时间40 s,浸提时间5 min和浸提温度20 ℃,分别设置微波功率为150、300、450、600、750(W),考察微波功率对栀子皂苷得率的影响;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇浓度80%(V/V),微波功率450 W,浸提时间5 min和浸提温度20 ℃,分别设置微波时间为10、20、30、40、50(s),考察微波时间对栀子皂苷得率的影响;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇浓度80%(V/V),微波功率450 W,微波时间40 s和浸提时间5 min,分别设置浸提温度为20、30、40、50、60 ℃,考察浸提温度对栀子皂苷得率的影响;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇浓度80%(V/V),微波功率450 W,微波时间40 s和浸提温度20 ℃,分别设置浸提时间为5、10、15、20、25 min,考察浸提时间对栀子皂苷得率的影响;

固定液固比10∶1 (mL/g),微波功率450 W,微波时间40 s,浸提时间5 min和浸提温度20 ℃,分别设置乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%(V/V),考察乙醇浓度对栀子皂苷得率的影响;每个实验平均三次,结果取平均值。

1.2.3 响应面优化试验设计 在单因素实验的基础上,考虑到乙醇浓度和微波功率对栀子皂甙得率影响相对较小,因此恒定乙醇浓度为80%,微波功率为450 W,采用Box-Behnken设计方法,以皂甙得率(Y)为响应值,以液固比(X1)、微波时间(X2)、浸提时间(X3)和乙醇浓度(X4)这4个因素为自变量进行响应面优化试验,具体因素水平见表1。

《普通高中数学课程标准(实验)》强调：“数学教学要使学生通过不同形式的自主学习、探究活动，体验数学发现和创造的历程.”从数学学科特点出发,根据不同的教学内容,有效合理地组织学生开展“探究教学”，是追求有效教学、构建高效课堂的重要途径.在目前课堂教学中，“探究教学”中探究的成分太少,有种“贴标签”的嫌疑.笔者认为，数学课堂教学过程中的每一个环节都可以渗透探究的元素、探究方法、探究思想.我们应力求让探究成为数学课堂教学的常态,应善于把握课堂教学中的每一个探究机会和细节，使数学探究逐步成为学生学习的自觉行为乃至形成习惯,促进学生思维充分、健康、全面发展.

表1 响应面因素及水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis

1.2.4 栀子皂甙得率的计算

1.2.4.1 溶液的配制 薯蓣皂甙标准对照液配制:精确称取薯蓣皂甙标准品固体1.00 mg于烧杯中,溶解于无水乙醇中,然后用无水乙醇定容到10 mL的容量瓶中,摇匀,得浓度0.10 mg/mL的薯蓣皂甙标准对照液。

5%香草醛冰醋酸溶液的配制:准确称取5.00 g香兰素粉末于烧杯中,加入浓度99.5%冰醋酸溶解,并定容到100 mL容量瓶中,混匀。

1.2.4.2 标准曲线的制作 根据文献[9]的方法,量取薯蓣皂甙标准品对照液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,分别置于10 mL具塞试管中,沸水浴一段时间直至溶剂被挥干,再将0.20 mL的5.0%香草醛冰醋酸溶液和0.80 mL的浓度99.5%高氯酸溶液加入试管中,密塞混匀,然后置于60 ℃中水浴显色15 min,显色完全后取出,冰水浴冷却5 min,然后加入5.0 mL的冰醋酸溶液,均匀混合,静置10 min。与空白试剂管对照,用分光光度计在波长544 nm处测其吸光度,横坐标为薯蓣皂甙浓度m(mg/mL),纵坐标为吸光度A,绘制薯蓣皂甙标准曲线,得线性回归方程为:A=0.9826m+0.0012,R2=0.9996。

1.2.4.3 得率的计算 将皂甙晶体用5.00 mL 95%乙醇溶解于具塞试管中,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法测其吸光度值,根据测得的标准曲线线方程计算栀子提取液中皂甙含量,栀子皂甙得率按式(1)计算。

式(1)

式中:Y为栀子皂甙得率,%;C为测定提取液中栀子皂甙浓度,mg/mL;V为栀子皂甙提取液体积,mL;M为栀子粉末质量,mg。

1.2.5 栀子皂甙抗氧化能力的测定

1.2.5.2 栀子皂甙还原能力的测定 取质量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的栀子皂甙溶液2.50 mL分别于10 mL离心管内,再加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸钠缓冲液和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液,50 ℃水浴20 min,加入2.5 mL 10%三氯乙酸后混匀,在3000 r/min离心10 min,取上清液5.0 mL再加5.0 mL水于试管中,再加1 mL 0.1%三氯化铁,摇匀混合后,静置10 min,在波长700 nm处测其吸光度,用抗坏血酸作比较;每个浓度均做3次平行试验[10]。计算吸光度的平均值。

1.2.5.2 栀子皂甙对DPPH清除力的测定 分别取质量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的栀子皂甙溶液2.0 mL,加入2.0 mL用无水乙醇配制的0.8 mmol/mL DPPH溶液,用力振摇混匀后在黑暗环境中静置30 min,于517 nm 处测定其吸光度,用抗坏血酸作比较[11];每个浓度均做3次平行试验,DPPH自由基清除率按式(2)计算。

式(2)

式中:Ax为加入样品溶液后的吸光度;Ax0为样品溶液本底的吸光度;A0为空白对照液的吸光度。

1.3 数据处理

实验操作重复三次取平均值,应用分析统计软件采用SAS RSREG程序对试验进行设计,并对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 液固比对皂甙得率的影响 如图1所示,皂甙得率随液固比的提高呈现先升后降的趋势,皂甙得率在液固比为20∶1 (mL/g)时达到最高,为10.03%,随着液固比的增加会增大传质驱动力,从而提高皂甙得率,但达到一定液固比20∶1 (mL/g)后反而减小，主要原因是浸提剂对微波能量的吸收增加,导致细胞液对微波能量的吸收减少,细胞壁的破裂不完全,皂甙不能从细胞中充分溶出[12]，因此，选择的液固比为20∶1 (mL/g)。

图1 液固比对栀子皂甙得率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.2 微波功率对皂甙得率的影响 从图2可以看出,皂甙得率随微波功率的提高呈现先升后降的趋势,在微波功率为450 W时,提取效果最好,皂甙得率达到最大值，为7.37%。微波功率过高可能会破坏皂甙分子结构,使热不稳定的粗皂甙提取物出现分解或部分分解现象[13],导致皂甙得率降低,而功率过低时,不能很好地破碎细胞使皂甙溶出,皂甙得率也较低。因此，选择的微波功率为450 W。

图2 微波功率对栀子皂甙得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.3 微波时间对皂甙得率的影响 由图3可知,随着微波时间的延长,皂甙的皂甙得率呈现先升后降的趋势,微波时间为40 s时,皂甙得率最高,为7.10%。原因可能是随着微波时间的延长,溶出物增多,栀子皂甙得率增高,继续延长微波时间,细胞膜进一步破裂,样品中的黏液质等杂质进入浸出液,使得浸出液黏度增大,从而扩散速度缓慢,皂甙得率反而变小[12]。因此，选择的微波时间为40 s。

图3 微波时间对栀子皂甙得率的影响Fig.3 Effect of microwave time on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.4 浸提温度对皂甙得率的影响 由图4可知,皂甙得率随浸提温度的提高呈现先升后降的趋势,皂甙浸提温度为50 ℃时,皂甙得率最大，为7.86%,表明温度越高越有利于皂甙的溶出,但是温度太高时,栀子中皂甙有可能发生氧化分解等变化,影响试验结果[14]。因此，选择的浸提温度为50 ℃。

图4 浸提温度对栀子皂甙得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.5 浸提时间对皂甙得率的影响 如图5可知,皂甙得率随浸提时间的提高呈现先升后降的趋势,浸提时间为10 min时,皂甙得率达到最大值,为11.02%。这是因为随着浸提时间的延长,栀子粉末与溶剂充分接触,皂甙分子溶出增多，皂甙得率增大,浸提时间较长时，过长时间浸泡在20 ℃的温度下,细胞膜进一步破裂,样品中的黏液质等杂质进入浸出液,使得浸出液黏度增大,从而使其扩散速度缓慢,过滤困难，导致皂甙损失[12]。因此，选择的浸提时间为10 min。

图5 浸提时间对栀子皂甙得率的影响Fig.5 Effects of extraction time on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.6 乙醇浓度对皂甙得率的影响 由图6可知,皂甙得率随乙醇浓度的增加呈现先升后降的趋势,乙醇浓度为80%时,皂甙得率达到最大值,为7.27%,在此浓度下提取效果最好。因为乙醇极性较高对栀子皂甙的溶解度大,乙醇浓度增大皂甙溶出率较多,但过高的浓度会对皂甙造成破坏作用而降低得率,在微波作用下这种差异更为明显[15]。因此，选择的乙醇浓度为80%。

图6 乙醇浓度对栀子皂甙得率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.2 响应面法优化提取工艺结果分析

2.2.1 回归模型的建立及显著性检验 根据Box-Behnken方法设计响应面结果见表2,将表2的试验数据进行处理和回归分析,并建立二次回归模型方程:

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Program and experimental results of response surface method

式(3)

对上述模型进行方差分析,结果见表3。此模型的p<0.0001,表明响应面模型达到极显著,失拟项p=0.1591>0.05,不显著,说明该模型与实际实验拟合度良好,R2=0.9206,说明该模型能解释92.06%实验数据的变异性,模型的拟合良好,试验误差小,模型的可行度较高。因此,该模型可用于栀子皂甙微波提取的分析和预测。

表3 模型回归方程方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression equation

2.2.2 响应面交互作用分析 响应曲面越陡峭,说明该因素对响应值改变越敏感,曲面越平滑,该因素改变对响应值影响越小[16],各因素的回归响应面图见图7,由此可见,随着微波时间(X2)和浸提时间(X3)两因素取值改变其响应曲面线变化也越陡峭,表明这两因素对栀子皂甙得率交互影响显著,其它因素之间随取值变化其响应曲面线变化较为平缓,表明其它两两因素的交互作用对栀子皂甙得率影响不显著,这与表3中交互项p值的分析结果一致,由图7还可以看出,6个响应曲面均为开口向下的凸形曲面,液固比(X1)、微波时间(X2)、浸提时间(X3)和乙醇浓度(X4)4个因素与栀子皂甙得率(Y)呈抛物线关系,且在考察范围内存在响应值的极高值。

图7 液固比、微波时间、浸提时间和乙醇浓度等交互作用对栀子皂甙得率的影响Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of liquid-solid ralio, microwave time,extract time and ethanol concentration on the the yield of Gardenin jasminoides Ellis

2.2.3 最佳工艺的提取与验证 由SAS软件综合分析得出,栀子皂甙提取最佳条件为:液固比21.44∶1 (mL/g)、微波时间40.02 s、浸提时间9.6 min、乙醇浓度80.05%,在此条件下栀子皂甙的得率预测值为13.64%。考虑到可行性,将以上结果校正为:液固比21∶1 (mL/g)、微波时间为40 s、乙醇浓度为80%、浸提时间为9.6 min。此条件下,重复实验5次,栀子皂甙平均得率为13.92%±0.04%,实际得率与理论预测皂甙得率的相对误差仅为2.05%,由此可见此模型和方法是可靠有效的。

2.3 栀子皂甙抗氧化能力测定结果

2.3.1 栀子皂甙还原能力的测定结果 由图8可知,栀子皂甙的还原能力随浓度的上升而增加,但远小于抗坏血酸的还原能力,此结论与武海霞[17]发现栀子皂苷具有良好的还原能力相一致,但是远小于抗坏血酸的还原能力的原因可能是微波辅助提取可能会对栀子皂甙的分子结构及其效用有一定的影响,从而导致其还原能力发生一定程度的改变[18]。

图8 栀子皂甙和抗坏血酸还原能力Fig.8 Comparison of reducing power between different concentration saponins in Gardenia jasminoides Ellis and ascorbic acid

2.3.2 栀子皂甙对DPPH自由基的清除能力测定结果 由图9可知,栀子皂甙和抗坏血酸对DPPH自由基的清除率随其浓度的提高而增大,与浓度呈现正相关性[19],但在栀子皂甙浓度从0.05增加至0.10 mg/mL时,DPPH自由基清除率增加到38.2%,随后增长速度趋于平缓;图9数据显示,相同浓度下栀子皂甙比抗坏血酸DPPH自由基清除能力要低,但清除率最高达38.2%,栀子皂甙对DPPH自由基具有一定的清除能力。

图9 栀子皂甙和抗坏血酸对DPPH自由基的清除效果Fig.9 Scavenging ability of different concentration saponins in Gardenia and ascorbic acid on DPPH

3 结论

通过单因素试验和响应面法试验,得到栀子皂甙提取的最佳条件为:液固比21∶1 (mL/g)、微波时间40 s、浸提时间9.6 min、乙醇浓度80%、微波功率450 W和浸提温度50 ℃。该条件下,得到实际栀子皂甙得率为13.92%±0.04%,与理论值13.64%相近,实际得率与理论预测皂甙得率的相对误差仅为2.05%;微波辅助法提取栀子皂甙简便、提取得率高,回归模型合理可靠,可用于实际预测;抗氧化活性研究表明，栀子皂甙对羟基自由基和DPPH自由基均有良好的清除能力,但其总体抗氧化性低于抗坏血酸,试验结果表明,栀子皂甙具有一定的抗氧化能力,可进一步开发成天然抗氧化剂。