不同载荷运动对去势雌性大鼠骨关节软骨形态学及代谢的影响

蔡 枭，安 洪，胡庭义， 陈 潇， 范 伟

(重庆医科大学 附属第一医院 骨科, 重庆 400016)

研究论文

不同载荷运动对去势雌性大鼠骨关节软骨形态学及代谢的影响

蔡 枭，安 洪，胡庭义， 陈 潇， 范 伟*

(重庆医科大学 附属第一医院 骨科, 重庆 400016)

目的研究不同载荷情况下运动对去势大鼠骨关节软骨形态学和代谢方面的影响。方法SD大鼠在成功制备为骨质疏松模型后，随机分为安静组、低载荷运动组、中载荷运动组和高载荷运动组，各10只进行跑台运动；运动3个月后处死大鼠，收取膝关节标本及血液，进行大鼠血清相关物质的检测，进行关节软骨形态学(HE染色、番红O染色、甲苯胺染色)检查及免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白含量。结果形态学及血清检测结果表明，中载荷运动组有利于维持关节软骨的稳态(Plt;0.05)；而与安静组、低载荷和中载荷运动组相比较，高载荷运动组则不利于关节软骨的生长，使关节软骨出现退变样改变(Plt;0.05)。结论不同载荷运动对大鼠膝关节软骨的影响不同，适度载荷运动对预防和治疗骨质疏松有较好的临床指导意义。

骨质疏松; 骨关节软骨; MMP-3；Ⅱ型胶原蛋白

骨质疏松是以骨量减少、骨组织显微结构破坏、骨强度减低而易发生骨折的一种全身性疾病，以绝经后的妇女多发[1]。研究已经表明运动可以改善绝经期患者骨量、骨密度和强度，并且能够有效预防骨质疏松[2- 4]。

适度运动是维持正常关节软骨形态结构及生理功能的必要条件，过度运动导致关节软骨退变[5- 6]。当关节软骨发生变化时，软骨基质中胶原等成分表达和分泌均发生变化[7]。

近些年来，预防和治疗骨质疏松症的研究越来越受到关注，运动是提高骨密度和预防骨质疏松症的重要手段之一。本实验通过对处于骨质疏松的大鼠给予不同强度的载荷运动干预，观察对骨质疏松大鼠骨代谢指标及骨组织形态的影响，以期为运动手段预防骨质疏松提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级雌性SD大鼠40只[体质量 290～340 g，重庆医科大学动物医学中心，SYXK(渝)2012- 0001]，8周龄，平衡膳食1周，5%水合氯醛 (7 mL/kg)经腹腔给麻醉，切除双侧卵巢。3个月后经双能X线检测骨密度，证实骨质疏松模型制备成功。随机分为：去势安静组(OVX,n=10)、去势低载荷运动组(low-loading OVX-RUN，L，n=10)、去势中载荷运动组(medium-loading OVX-RUN，M,n=10)、去势高载荷运动组(high-loading OVX-RUN,H,n=10)分笼饲养。

1.1.2 实验试剂：免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)；钙、磷试剂盒、 II 型胶原鼠抗兔多克隆抗体和 MMP-3 Elisa 试剂盒(武汉博士德生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 运动方案： 在正式实验开始前1周每天在跑步机中以慢速(10～15 m/min)跑步30 min，以适应跑道。正式实验后，运动方案参照文献[8- 9]运动处方稍做改进,建立不同的运动载荷模型，最大负重(218±10)g，每次运动1 h，6 d/周，共计12周(表1)。

1.2.2 软骨厚度测量： 使用带刻度莱卡显微镜进行手工测量，每张切片从最厚到最薄平均取6个不同的厚度进行测量，测量从软骨表面到钙化层的厚度，结果用μm表示。

表1 不同运动载荷模型Table 1 Different loading exercise model

1.2.3 血清ELISA检测MMP-3水平:运动12周后，以水合氯醛注射腹腔麻醉，打开胸腔，从心尖部进针抽血5 mL，低温2 000 r/min离心15 min，收集上清液，置-80 ℃保存。ELISA法测定血清MMP-3浓度。

1.2.4 番红-O染色: 石蜡切片，常规脱蜡至水，于0.1%番红-O染液染色。在光镜下(×400)下由两位独立观察者按Mankin评分标准进行评分，取两者均值作为最终得分。

1.2.5 甲苯胺蓝染色:石蜡切片，常规脱蜡至水，经甲苯胺蓝染色后。在光镜下(×400)观察骨与软骨细胞的形态变化。

1.2.6 Ⅱ型胶原蛋白含量测定:按Ⅱ型胶原蛋白试剂盒所示方法测定，采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件，高倍镜(×400)下选定单位面积，测定单位面积Ⅱ型胶原蛋白平均吸光度值。

1.2.7 血清中离子测定:血清钙(Ca)测试方法采用的是甲基百里香酚蓝比色法，通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出钙的含量。血清磷(P)测试方法采用的是孔雀绿直接显色法，在一定范围内，颜色深度与含量成正比。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 组织学结果

2.1.1 HE染色：安静组软骨表面平滑，软骨细胞呈圆形或是椭圆形位于软骨陷窝内，排列较规则(图1A)；低载荷运动组软骨细胞增多，细胞排列规则(图1B)；中载荷运动组较低载荷运动组软骨细胞明显增多，排列规则(图1C)；高载荷运动组软骨表面不规则，软骨细胞减少明显，钙化层可见大量肥大的软骨细胞，并且伴有血管翳形成(图1D)。

2.1.2 番红O染色：安静组软骨表面光滑，软骨细胞呈圆形或者椭圆形，基质番红O染色均匀，染色较淡呈紫色(图2A)；低载荷运动组细胞增多，染色深(图2B);中载荷运动组细胞数目及染色较前两组增加，可见清晰的潮线(图2C)；高载荷运动组可见软骨表面欠规则，移形层及放射层细胞数减少，潮线不规则，钙化层出现肥大细胞(图2D)。

2.1.3 甲苯胺蓝染色：安静组软骨细胞排列欠规则(图3A)；低载荷运动组细胞数目明显增多，排列规则，可见潮线(图3B);中载荷运动组细胞数目明显增多，排列规则，潮线规则(图3C)；高载荷运动组染色较浅，软骨细胞数目减少，细胞排列也欠规则，潮线消失(图3D)。

2.2免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白及Ⅱ型胶原蛋白平均吸光度值

安静组软骨基质染色呈棕黄色，主要分布于软骨表层及放射层(图4A)；低载荷运动组基质染色较深，主要分布于表层及放射层(图4B)；中载荷运动组较其他组明显加深，细胞数目较多(图4C)；高载荷运动组可见染色较其他组减少，细胞数目减少(图4D)。与OVX组比较，M组Ⅱ型胶原蛋白平均吸光度值明显升高(Plt;0.01)，H组吸光度值则明显降低(Plt;0.01)(表2)。

图1 各组关节软骨HE染色情况的差异Fig 1 Differences among groups of articular cartilage HE dyeing(×400)

图2 各组关节软骨番红O染色差异Fig 2 Differences among groups of articular cartilage sarranine O dyeing(×400)

图3 各组关节软骨甲苯胺蓝染色情况的差异Fig 3 Differences among groups of articular cartilage Toluidine blue dyeing(×400)

groupaverageopticaldensityoftypeⅡcollagenOVX 0.03±0.00L 0.03±0.01M 0.04±0.01*#H 0.02±0.00*#

*Plt;0.01 compared with OVX；#Plt;0.05 compared with L.

2.3 各组大鼠血清钙、磷浓度

与OVX组相比，L、M组钙、磷含量明显降低，H组含量明显增高(Plt;0.05)。与L组相比，M组钙、磷含量也明显较低(Plt;0.05)(表3)。

表3 血清钙、磷浓度

*Plt;0.01，**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01；##Plt;0.05 compared with L.

2.4 各组大鼠关节软骨厚度、Mankin评分

L、M组关节软骨厚度较OVX组明显增厚(Plt;0.01),H组的软骨厚度则明显减少。M组的Mankin评分与L组比较明显较低，H组的Mankin评分则明显升高(Plt;0.01)(表4)。

2.5 血清中MMP-3浓度

与OVX组相比较,L、M组MMP-3含量明显较低(Plt;0.05)；与L组相比较，M组MMP-3的含量未见明显变化,而H组的MMP-3的含量则明显增高(Plt;0.01)(表5)。

表4 关节软骨厚度、Mankin评分

*Plt;0.01，**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01；##Plt;0.05 compared with L.

表5 血清中MMP-3浓度Table 5 Expression of MMP-3 in blood (±s，n=10)

*Plt;0.01,**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01，##Plt;0.05 compared with L.

3 讨论

本实验通过采用均为正常年龄的雌性大鼠模拟骨质疏松的模型来研究不同载荷运动对骨关节软骨形态学及代谢的影响，而老年的大鼠由于存在雌激素水平的降低导致骨量的丢失，会对实验结果产生影响。

本实验低载荷及中载荷运动可以降低大鼠血清中的钙、磷、MMP-3的含量，尤其以中载荷更为明显，证明适宜载荷运动可以降低血钙、磷及MMP-3的含量,对骨代谢产生了有益的作用，促进了骨骼的矿化。这与目前多数研究结果“大鼠运动后血清中钙及MMP-3的浓度明显减少”。同时低、中载荷可以增加关节软骨的厚度，Mankin评分则较低。而高载荷运动的软骨厚度明显降低，Mankin评分则明显较高。结果均表明高载荷运动组对关节软骨产生负面的效应，而中载荷运动组有利于维持骨关节软骨稳态。

细胞外基质的主要成分包括Ⅱ型胶原和蛋白聚糖聚集物,二者的转换和降解失衡时，导致关节软骨发生降解，最终出现关节软骨的破坏[10- 11]。Ⅱ型胶原免疫组化结果提示,低、中载荷运动组对维持关节软骨的形态是有利的,而高载荷运动组对关节软骨的形态产生负作用，出现了关节软骨的破坏。

基于上述研究结果，低载荷和中载荷运动为利于大鼠关节软骨生存的“安全窗口”。运动对机体的影响是双向的，最终结果取决于负荷大小。适度的主动运动对于关节软骨具有保护作用，而且在一定运动负荷内，运动的强度越大则表现出更好的效果，过度的运动负荷可使骨性关节炎的发生率更高，而中等以下强度的运动有益于软骨的健康。本研究结果证实不同的力学负荷对关节软骨的影响不一，适宜的力学负荷在改善骨质疏松状况的情况下，有利于骨关节软骨的健康，而过度的力学负荷不仅不利于骨质疏松的改善，而且还导致关节软骨的破坏。

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Effect of different loading exercise on morphology and metabolism of articular cartilage in ovariectomized female rats

CAI Xiao, AN Hong, HU Ting-yi, CHEN Xiao, FAN Wei*

(Dept. of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate the influence of loading exercise on morphology and metabolism of articular cartilage in ovariectomized rats.MethodsForty female Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 4 groups: ovariectomized (OVX), ovariectomized plus low loading exercise (low loading OVX-RUN), ovariectomized plus medium loading exercise (medium OVX-RUN), ovariectomized plus high loading exercise (high loading OVX-RUN); After 12 weeks, the following variables were compared among the 4groups. Knee joint and blood samples were collected; Test of rat serum related material were carried on the articular cartilage morphology (HE dyeing, sarranine O dyeing, toluidine) examination and immunohistochemical staining to detect the content of type Ⅱ collagen in articular cartilage.ResultsMedium OVX-RUN group was helpful to maintain the steady state of articular cartilage (Plt;0.05). Compared with OVX,low loading OVX-RUN group and medium OVX-RUN group, high loading OVX-RUN group was not conducive to the growth of the articular cartilage,induce the degenerative-like changes in articular cartilage(Plt;0.05).ConclusionsThe different loading exercise has different effect on the cartilage of rats, moderate loading exercise on the prevention and treatment of osteoporosis has useful clinical significance.

osteoporosis; articular cartilage；matrix metalloproteinase-3；type Ⅱ collagen

2014- 01- 16

2014- 04- 12

*通信作者(correspondingauthor)：fanweicqmu@163.com

1001-6325(2014)06-0792-05

R 322.7+1

A