KLF9基因腺病毒载体的构建及其抗ROS功能

焦 涛，崔安芳，常永生

(中国医学科学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

研究论文

KLF9基因腺病毒载体的构建及其抗ROS功能

焦 涛，崔安芳，常永生*

(中国医学科学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

目的构建及鉴定KLF9基因过表达的腺病毒载体，初步研究KLF9在对抗反应活性氧方面的功能。方法克隆KLF9过表达质粒，定向克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV，PmeⅠ酶切线性化，转化E.coli.BJ5183(含腺病毒载体pAdEasy-1)感受态细菌，产生重组腺病毒载体。重组载体经过卡那霉素抗性筛选和限制性内切酶分析确认重组后，再用PacⅠ线性化重组质粒，回收，转染293A细胞，7～12 d包装产生病毒颗粒。利用H2O2和过表达KLF9的腺病毒处理体外培养的C57BL/6J小鼠原代肝脏细胞，实时定量PCR检测KLF9和抗ROS基因(CAT、SOD2和GPx1)的表达。结果H2O2可以刺激C57BL/6J小鼠原代肝脏细胞KLF9和抗ROS基因的表达上调(Plt;0.05)。定量PCR以及Western blot结果显示成功包装过表达KLF9腺病毒，感染效率达90%以上。过表达KLF9可以上调抗ROS基因的表达水平(Plt;0.05)。结论初步认定KLF9基因可参与C57BL/6J小鼠原代肝脏细胞中抗ROS基因的调节。

KLF9；腺病毒；反应活性氧

反应活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。正常状态下，氧化磷酸化过程中消耗的氧0.4%～4.0%转化为过氧化物，并最终解毒成O2和H2O2。当机体的防御机制无法抵抗活性氧的产生，就会产生氧化应激，诱导生物大分子(如DNA、蛋白质、脂类等)发生超氧化反应而产生突变或损伤，引起细胞结构、功能破坏[1]。机体内抗氧化防御机制主要有两种：抗氧化酶类如超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，SOD2)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等，非酶类分子则包括谷胱甘肽(glutathione，GSH)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)和维生素A、C、E等[2]。

Krüppel样转录因子(Krüppel-like factors，KLFs)是一类Cys2/His2锌指结构-DNA结合蛋白[3]，在细胞的增殖、分化、凋亡[4]和组织器官发育[5]中发挥重要作用。目前的研究表明有许多KLF家族成员都与机体的能量代谢有关。Krüppel样转录因子9(KLF9)，又称为基础转录元件结合蛋白-1(basic transcription element-binding protein-1，BTEB1)，是KLF家族中的重要成员，最初从大鼠肝脏 cDNA文库中克隆得到[6]。但是有关KLF家族在能量代谢和ROS方面的研究鲜有文章报道。本研究初步探讨KLF9在抗反应活性氧中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

KLF9扩增序列引物(Invitrogen公司)，扩增序列：5′-GAATTCCCACCATGTCCGCGGCCGCCTACA-3′(正向)和5′-CTCGAGTCACAAGGGGCTGGC-3′ (反向)，两端分别添加KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点，C端加Flag标签。KpnⅠ和XbaⅠ酶、T4 DNA连接酶、pyrobest Taq DNA聚合酶、dNTPs(Takara公司)。T-easy质粒、实时定量PCR试剂盒(Promega公司)。Lipofectamine2000、细胞培养基DMEM、RPMI1640、 Trizol(Invitrogen公司)。pAdTrack-CMV、pAdTrack-U6、E.coli. BJ5183、DH5 感受态细菌以及人胚肾细胞系293A由本实验室保存。反转录试剂盒(ABI公司)。胎牛血清、青霉素、链霉素(Hylone公司)。明胶和胶原酶(Sigma公司)。六周龄的雄性C57BL/6J小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心[许可证号为SCXK-(军)2012-0004]。小鼠饲养和管理按照中国医学科学院的实验动物标准执行。

1.2 KLF9基因重组质粒的构建及腺病毒包装

将测序正确连接在T-easy质粒上的KLF9酶切下来，定向插入穿梭载体pAdTrack-CMV。提取穿梭质粒，取5 μg质粒，经PmeⅠ酶切7 h充分线性化，酚/氯仿抽提，溶于20 μL去离子水中。取100～500 ng酶切质粒转化E.coli. BJ5183感受态细菌。以500 mL LB培养基重悬细菌，涂于卡那霉素抗性的LB平板，置于37 ℃孵箱内培养16～20 h。挑取较小的克隆摇床过夜，提质粒，经PacⅠ酶切可得30.0和4.5 kb两条带，即为阳性克隆。将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌DH5，提取质粒。取12 μg所得的重组质粒，用PacⅠ 酶切7～9 h，经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于去离子水。将回收质粒以转染密度50%～70%接种于T-25培养瓶的293A细胞。孵箱中培养10～15 d，不用换培养基，隔天补500 μL DMEM完全培养基。一般转染5～7 d后可以通过荧光显微镜观察到GFP斑。

1.3 KLF9腺病毒的扩增

转染后10～12 d，收取细胞，转入50 mL离心管。重悬于PBS中，在液氮和37 ℃反复冻融4次，收集病毒裂解液。第2轮扩增，加病毒裂解液到2个T-25瓶子(接种293A细胞，汇合度90%)，细胞全部呈绿色且30%～50%细胞悬浮时，收集细胞，重悬于PBS中，在液氮和37 ℃反复冻融4次，收集病毒裂解液。第3轮扩增，加病毒于10个Φ100 mm大皿中(接种293A细胞，汇合度90%)，其余步骤同第2轮扩增。

1.4 细胞培养及小鼠肝原代细胞处理

采用10%胎牛血清的DMEM培养基培养293A细胞，培养基中添加100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素。细胞在37 ℃、5% CO2的孵箱中培养，实验时取对数生长期细胞。用经典的灌流胶原酶消化法获取成活率为90%以上的C57BL/6J小鼠肝脏原代细胞，铺至6孔板中，用1640(10%血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉索)培养，在37 ℃、5% CO2的饱和湿度箱中培养。用浓度为1 mmol/L的H2O2处理C57BL/6J小鼠原代肝脏细胞，对照组加等量的PBS，在37 ℃、5% CO2的饱和湿度温箱中培养2 h，然后弃去培养基，用PBS清洗两次，换新鲜的完全培养基再培养2 h后去掉培养基，用1 mL Trizol提取RNA。向C57BL/6J小鼠原代肝脏细胞中加过表达KLF9的腺病毒及其对照Ad-GFP，6 h以后更换新鲜的培养基继续培养。24 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白完全表达，去掉培养基，用1 mL Trizol提取RNA。

1.5 总RNA提取和Real-time PCR

Trizol法提取小鼠原代肝脏细胞总RNA，紫外分光光度计定量，取2 μg总RNA，加入随机引物用Multi Scribe反转录酶反转录成cDNA。以1 μg cDNA为模板，在CFX-96仪器(BIO-RAD公司)上进行扩增反应。条件为：95 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(捕捉荧光值)，循环40次，并作熔解曲线。各基因的定量PCR引物序列见表1。样本结果以目的基因与β-actin的比值做相对定量分析，数据分析采用比较CT法，重复样本(n=3)取平均值。

表1 实时定量PCR的引物序列

1.6 Western blot

蛋白样品以SDS-PAGE(分离胶浓度为10%)分离；电泳结束后将凝胶中的蛋白样品电转至PVDF膜上，电转1.5 h，封闭液室温封闭PVDF膜1.5 h；PVDF膜置于一抗(anti-Flag：1∶8 000)溶液中，4 ℃摇床过夜；TBST洗PVDF膜4次，每次10 min；PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的二抗(用TBST配制的2.5% BSA以1∶5 000稀释)室温作用1～2 h；TBST洗PVDF膜4次，每次10 min；将ECL液体以0.1 mL/cm2膜的用量滴加在PVDF膜上，室温1 min。迅速吸去多余的ECL液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室曝光。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1H2O2刺激小鼠的原代肝脏细胞KLF9及抗ROS基因的表达上调

与对照组相比，H2O2处理的C57BL/6J小鼠原代肝脏细胞中，KLF9以及抗ROS基因的表达水平均明显上调(Plt;0.05)(图1)。

*Plt;0.05 compared with PBS group图1 H2O2刺激小鼠的原代肝脏细胞抗ROS基因表达上调Fig 1 The expression of anti-ROS genes was upregualted in mouse primary hepatocytes following H2O2 treatment

2.2KLF9基因过表达腺病毒的包装及原代肝细胞水平验证

PCR扩增约1 000 bp片段，连接T-easy载体，经过测序与NCBI上报导的序列一致。重组质粒，经PacⅠ酶切后，产生30.0 kb和4.5 kb左右的两条带。PacⅠ 线性化的质粒，转染293A细胞，约7～10 d 可见明显的扩增斑(图2A)。实时定量PCR检检测，与空白对照组及感染Ad-GFP组相比，感染Ad-KLF9腺病毒组原代肝细胞中KLF9的表达量上调约20倍(Plt;0.01)(图2B)。Western blot实验检测感染Ad-KLF9的原代肝脏细胞，在相对分子质量38 ku处有一条非常特异的条带，而感染Ad-GFP的对照组则没有条带(图2C)。

A.the viral multiplied plaque when transfeced into 293A cells 8 th day(×20);B.the expression ofKLF9 in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9(*Plt;0.01 compared with Ad-GFP and blank);C.the expression ofKLF9 in protein level when infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

图2KLF9基因腺病毒载体的包装验证

Fig2TheidentificationofKLF9adenoviralvector

2.3KLF9激活小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达

与感染Ad-GFP对照组相比，过表达KLF9可以明显诱导CAT、SOD2、GPx1等抗ROS相关基因的表达上调(Plt;0.05)(图3)。

3 讨论

反应活性氧(ROS)能与DNA、蛋白质、脂类等反应，在许多生理和病理过程中发挥重要的作用，如糖尿病、神经退行性疾病、癌症、衰老等[7- 8]。细胞内ROS的清除途径主要是通过ROS去毒酶，包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPxl)和超氧化物歧化酶(SODs)等[1]。

*Plt;0.05 compared with Ad-GFP图3 KLF9上调小鼠原代肝细胞抗ROS基因的表达Fig 3 The expression of anti-ROS genes in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

研究表明有许多KLF家族成员包括KLF2、KLF5和KLF15参与脂代谢。例如敲低KLF4可以影响脂肪合成[9]。KLF5敲除小鼠的白色脂肪组织发育不良，而且过表达KLF5可以促进前脂肪细胞3T3-L1的分化。而KLF5又可以与C/EBPβ相互作用，从而促进PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)基因的表达[10]。这些KLF家族在脂肪细胞中的作用提示KLF9很可能在能量代谢ROS清除中起作用。

本研究首先用H2O2刺激C57BL/6J小鼠的原代肝细胞，检测和抗ROS相关基因的表达，然后用过表达的腺病毒感染原代肝细胞。结果显示可通过增加细胞中清除ROS基因的表达而提高细胞的抗氧化应激能力，为其用于治疗与ROS有关的疾病奠定了理论基础。

腺病毒载体系统能够实现基因在哺乳动物和细胞中高效表达，该实验方法目前应用非常广泛。本研究包装成功的腺病毒感染肝原代细胞效率可以达到90%以上，为在细胞水平功能的研究提供了有力手段。而且腺病毒能够特异且高效地感染肝脏细胞，实现KLF9基因在肝脏中过表达，为KLF9可能的基因治疗提供了保证。

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KLF9 adenoviral vector construction and it’s function in anti-ROS

JIAO Tao, CUI An-fang, CHANG Yong-sheng*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo construct the adenoviral overexpressing vector of Krüppel-like factor 9(KLF9) and to explore the role ofKLF9 in the regulation of anti-ROSgenes expression.MethodsTheKLF9 gene is cloned into the shuttle vector pAdTrack-CMV. The resultant plasmid is linearized by digesting with restriction endonucleasePmeⅠ, and subsequently cotransformed intoE.coli. BJ5183 competent cells with pAdEasy-1.Recombinants are selected for kanamycin resistance and recombination confirmed by restriction endonuclease analyses. Finally, the linearized recombinant plasmid is transfected into 293A cells. Recombinant adenoviruses are typically generated within 7 to 12 days. The mouse primary hepatocytes are isolated from the C57BL/6J mouse and subsequently H2O2treatment is conducted. We aslo performedKLF9 overexpression by using Ad-virus system (Ad-KLF9) in mouse primary hepatocytes isolated from the C57BL/6J mouse. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis was further performed to determine the expression of anti-ROSgenes including catalase(CAT), manganese superoxide dismutase(SOD2) and glutathione peroxidase 1(GPx1).ResultsThe expression ofKLF9 and anti-ROSgenes were upregualted in C57BL/6J mouse primary hepatocytes following H2O2treatment (Plt;0.05).The results of qRT-PCR

and Western blot proved that adenoviral vector ofKLF9was successfully produced with 90% infection efficiency. The expression of anti-ROSgenes were also upregualted in C57BL/6J mouse primary hepatocytes after infecting with Ad-KLF9(Plt;0.05).ConclusionsKLF9 represents its impact on the expression of anti-ROSgenes.

KLF9; adenovirus; ROS

2014- 03- 08

2014- 04- 11

国家自然科学基金(81170763)

*通信作者(correspondingauthor)：changy@ibms.pumc.edu.cn

1001-6325(2014)06-0762-05

R 73

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