姜黄素对紫外线诱导损伤的HaCaT细胞的保护作用

邓蕙妍，高爱莉，张倩雯，万苗坚，朱慧兰

（1.广东省广州市皮肤病防治所，广州510095；2.中山大学附属第三医院，广州510630）

短时间内高强度紫外线（Ultraviolet，UV）照射人及动物皮肤后会引起红斑、水肿、大疱、脱屑、色素沉着等一系列急性光损伤的表现。紫外线引起皮肤急性光损伤的机制复杂，至今未完全阐明，既往研究显示，在人皮肤急性光损伤的发病机制中，UVA、UVB引起的氧化应激反应占有重要地位，是造成皮肤红斑、水肿等急性炎症反应的重要原因。在氧化应激反应中，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）充当了非常重要的角色。近年来的研究明确了ROS可影响皮肤结构的完整性，并对下游分子的调控有肯定的作用，其中包括信号转导、基因表达和最终致癌性的启动等[1]。由此可见，降低ROS水平是减少UV对皮肤氧化损伤的重要一环。

姜黄素是传统草药姜黄的主要成分，多项研究提示姜黄素是强大的抗氧化剂，在多种细胞中被证实可清除胞内ROS，有抗氧化作用[2-5]。但到目前为止，有关姜黄素对皮肤的抗氧化作用及其机制探讨的相关报道不多。为探讨姜黄素是否具有拮抗皮肤急性光损伤的作用，其对不同波长紫外线造成皮肤损伤的保护作用如何，本实验比较了姜黄素干预前后，经过UVA、UVB辐射的人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）损伤程度变化及胞内ROS水平的改变。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品 永生化人表皮角质形成细胞HaCaT细胞，购自广州吉妮欧生物科技有限公司

1.1.2 主要试剂和仪器 姜黄素购自美国SIGMA公司，AnnexinV-FITC+PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展公司，单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司，CM-H2DCFDA荧光探针购自美国Invitrogen公司。UVB灯管，波长范围290～320 nm，峰值 297 nm，40 W，UVA 灯管,波长范围320～400 nm，峰值365 nm，40 W，均购自北京电光源研究所，酶标仪购自美国Diatek公司。

1.2 方法

1.2.1 UVA、UVB最佳剂量的确定和HaCaT细胞急性光损伤模型的建立，参考本课题组的前期研究结果[6]，在本实验中使用 UVA剂量为20 J/cm2，UVB剂量为57 mJ/cm2。

1.2.2 筛选无毒性的姜黄素浓度

1.2.2.1 HaCaT细胞随机分为正常细胞对照组、细胞+1 μmol/L姜黄素组、细胞+2.5 μmol/L姜黄素组、细胞+5 μmol/L姜黄素组、细胞+10 μmol/L姜黄素组、细胞+20 μmol/L姜黄素组。分组加好药物后37℃培养24 h。

1.2.2.2 MTT法检测姜黄素对细胞增殖效应的影响细胞分组处理后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20 μL继续孵育4 h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加 150 μL的DMSO，振荡10 min。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.2.3 Annexin V-PI双染流式细胞仪检测姜黄素对细胞凋亡率的影响 细胞分组处理后，吸出培养液，适度消化，800 r/min离心15 min，去上清。预冷PBS洗2次，800 r/min离心15 min，收集细胞沉淀；打入70%（预冷）乙醇，4℃固定过夜；取出复温，800 r/min离心 15 min，去乙醇，预冷 PBS洗 2次，800 r/min离心15 min，加0.5 mL Binding Buffer悬浮细胞，在悬浮细胞液中加入 5 μL AnnexinVFITC，2～8℃避光孵育15 min。加入10 μL碘化丙啶（PI）后于2～8℃避光孵育10 min，300目（孔径40～50 μm）尼龙网过滤，上机检测。

1.2.3 MTT法检测添加姜黄素前后，UVA、UVB照射对细胞增殖效应的影响 方法同1.2.2.2。

1.2.4 Annexin V-PI双染流式细胞仪检测添加姜黄素前后，UVA、UVB照射对细胞凋亡率的影响 方法同1.2.2.3。

1.2.5 流式细胞仪检测HaCaT细胞内ROS水平变化

1.2.5.1 HaCaT细胞随机分为正常细胞对照组、细胞+UVA照射组、细胞+UVB照射组、细胞+各无毒性浓度姜黄素组、细胞+各无毒性浓度姜黄素+UVA照射组、细胞+各无毒性浓度姜黄素+UVB照射组

1.2.5.2 各组HaCaT细胞加入不同浓度的姜黄素处理及光照后换回新鲜的完全培养基，继续培养18h，对照组不进行照射直接换成完全培养基，继续培养18 h。弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗1次，用胰酶消化成单细胞悬液，加入终浓度为5 μmol/L的 CM-H2DCFDA染液，37℃孵育15 min，离心，PBS漂洗1次后，上流式细胞仪检测。

1.2.6 各组数据用均数±标准差表示。采用SPSS19.0统计软件对2组数据进行配对t检验。显著性检验标准为P<0.05。

2 结果

2.1 筛选无毒性的姜黄素浓度 当姜黄素浓度为1 μmol/L 和 2.5 μmol/L 时，HaCaT 细胞增殖没有差异，浓度为5 μmol/L时，增殖受抑制，差异有统计学意义（P<0.05），浓度为 10 μmol/L 和 20 μmol/L 时差异更明显（P<0.05）。结果说明细胞增殖受姜黄素浓度影响，且随浓度增加而降低，见图1。流式细胞仪检测结果提示，姜黄素浓度在20 μmol/L时，检测到细胞凋亡有小幅上调，其余浓度没有明显变化，见图2。结合细胞增殖和凋亡的检测结果，我们认为姜黄素浓度在5 μmol/L以下时，姜黄素对HaCaT细胞没有损伤。由此，我们确定下步实验所需姜黄素浓度梯度为 1，2.5，5 μmol/L。

2.2 添加姜黄素前后，UVA、UVB照射引起HaCaT细胞损伤变化 无UVA照射时，添加不同浓度姜黄素，HaCaT细胞增殖和凋亡情况与空白对照差异无统计学意义（P＞0.05）；有UVA照射时，不添加姜黄素，细胞增殖明显抑制（下降25%）、凋亡增加（增加13.5%）（P<0.05）；添加不同浓度姜黄素，细胞增殖抑制幅度降低，凋亡细胞减少（P<0.05），呈浓度依赖性，见图3、图4。同样，无UVB照射时，添加不同浓度姜黄素，HaCaT细胞增殖和凋亡情况与空白对照差异无统计学意义（P＞0.05）；有UVB照射时，不添加姜黄素，细胞增殖明显抑制（下降25%）、凋亡增加（增加 11.9%）（P<0.05）；添加不同浓度姜黄素，细胞增殖抑制幅度降低，凋亡细胞减少（P<0.05），呈浓度依赖性，见图5、图6。

2.3 HaCaT细胞内ROS水平变化 从流式结果可见，在没有UVA照射情况下，细胞内ROS水平较低，且各姜黄素浓度间差异不大；有UVA照射时，ROS水平大幅上升，与正常细胞相比，ROS增高67.9%。但随姜黄素浓度升高，升幅减少，呈浓度依赖性，姜黄素浓度达到5 μmol/L时，ROS水平仅升高13.3%，与UVA照射组相比下降54.6%，见图7。同样，在没有UVB照射情况下，细胞内ROS水平较低，且各姜黄素浓度间差异不大；有UVB照射时，ROS水平大幅上升，与正常细胞相比ROS增高67.2%。但随姜黄素浓度升高，升幅减少，呈浓度依赖性，姜黄素达到 5 μmol/L时，ROS水平仅升高14.3%，与单独UVB照射组相比下降52.9%，见图8。

3 讨论

由于臭氧层的破坏和人们生活习惯的改变，急性光损伤的发生率越来越高，如何减轻急性光损伤的危害日益受到关注。因此，研究急性光损伤的发病机制及防治药物具有重大的医学和社会经济价值。

传统观点认为，UVB可穿透皮肤几毫米，主要由表皮吸收而引起皮肤红斑，其照射是对皮肤产生光化学反应中最活跃的部分，是导致皮肤晒伤的根源，造成皮肤损伤的主要原因，而UVA穿透真皮，引起红斑的可能性是UVB的千分之一，一般不引起皮肤损伤[7]。但最近研究表明，虽然UVA和UVB因波长不同，被皮肤吸收多少不一，实际上均会对皮肤造成急、慢性损伤，甚至导致各种皮肤肿瘤的发生[8]。由上述可知，为避免表皮细胞日晒伤，UVA和UVB的预防同样重要，寻找对两种不同波长紫外线照射都有防护作用的防治药物有重要意义。

目前对紫外线的防护分为物理防护和化学防护，不同原理的紫外线防护剂各有优势。近年的研究表明紫外线急性照射可以引起表皮细胞DNA损伤、氧化应激和免疫抑制，其中，氧化应激是造成皮肤红斑、水肿等急性炎症反应的重要原因。在氧化应激反应中，ROS充当了非常重要的角色。为了减少ROS对机体的损伤，国内外学者设想用抗氧化药物抑制ROS的生物毒性。在众多抗氧化剂中，传统草药姜黄根茎中的姜黄素被广泛关注。姜黄素的抗氧化作用强大，是维生素E的10倍以上[9]，且价格低廉，水溶性和脂溶性均好，低毒高效，另外其提取工艺成熟、不复杂，是理想的天然抗氧化剂。在本实验中，姜黄素浓度达到20 μmol/L时，HaCaT细胞才出现明显的凋亡和坏死；但其浓度在5 μmol/L时细胞的增殖就受到抑制，活力下降。实验结果说明，姜黄素浓度大于5 μmol/L时，姜黄素对HaCaT细胞的生长开始有影响，但由于浓度不足以对细胞产生致命伤害，所以检测不到凋亡和坏死的增高，当浓度超过20 μmol/L时，高浓度的姜黄素对HaCaT细胞的伤害显著，所以检测到细胞凋亡和坏死的明显增加。为了使姜黄素发挥作用的同时不对细胞本身的生长产生影响，我们确定了1，2.5，5 μmol/L等浓度作为后续实验的姜黄素浓度梯度。

曾有国内研究进行了姜黄素对UVB诱导的HaCaT细胞内ROS水平影响的实验，证实了姜黄素对UVB的急性氧化损伤有抑制作用[10]，但在现实生活中，除了UVB以外，表皮细胞还会受到UVA照射损伤。此外，除了胞内的ROS水平改变，细胞的生长状态是否也恢复呢？因此，为探讨姜黄素是否对两种波长的紫外线照射都有防护作用，其作用强度是否一致，本实验通过细胞增殖和凋亡等生长状态和胞内ROS水平，比较姜黄素对UVA、UVB两种紫外线照射的防护作用。我们对HaCaT细胞进行姜黄素预处理后，分别进行了最佳剂量的UVA、UVB照射。结果显示与添加姜黄素前相比，HaCaT细胞的增殖抑制幅度降低，凋亡细胞减少，细胞的损伤程度下降，细胞的生长状态改善与姜黄素浓度呈正相关。胞内的ROS水平与单纯UV照射组比较明显降低，而且随着姜黄素浓度的增高，ROS水平下降越明显，姜黄素达到5 μmol/L时，与单纯UVA照射的HaCaT细胞相比，添加姜黄素后再照射的细胞内ROS水平升幅降低54.4%，而UVB照射组中，ROS水平升幅降低52.9%。实验结果证明姜黄素对紫外线照射的HaCaT细胞具有抗氧化保护作用，并且呈浓度依耐性，比较添加姜黄素前后，UVA、UVB照射引起的ROS水平变化，可以看出姜黄素对UVA、UVB两种波长诱导的HaCaT细胞光损伤具有相同的保护作用，但其通过何种机制发挥作用尚需要进行下一步实验深入探讨。

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