普萘洛尔治疗增殖期血管瘤的疗效及治疗前后血管内皮生长因子A和缺氧诱导因子1α的表达

凌彬 尹小朋 刘洁 张静 龚忠诚 林兆全

普萘洛尔治疗增殖期血管瘤的疗效及治疗前后血管内皮生长因子A和缺氧诱导因子1α的表达

凌彬 尹小朋 刘洁 张静 龚忠诚 林兆全

目的分析普萘洛尔治疗增殖期婴幼儿血管瘤的临床疗效，并检测治疗过程中血清及尿液中血管内皮生长因子A（VEGF-A）和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达水平。方法增殖期婴幼儿血管瘤30例，口服普萘洛尔治疗，剂量为0.5～2 mg·kg-1·d-1。治疗前、治疗4周后、12周后分别测量瘤体半径，采用四级评估法及患者父母反馈进行临床疗效评估，酶联免疫吸附试验检测血清及尿液中VEGF-A和HIF-1α水平。健康对照组为儿保科正常体检婴幼儿30例。组间比较采用两因素方差分析，两两比较采用LSD法。结果患者组治疗12周后，2例疗效为优，11例好，14例中等，3例差。健康对照组血清VEGF-A水平为（268.174±95.056）μg/L，HIF-1α水平为（10.809±1.686）mg/L。患者组治疗前血清VEGF-A水平为（385.692±136.146）μg/L，服药 4周后为（264.853 ± 122.12） μg/L，12周后为（211.345±104.035） μg/L，呈逐渐下降趋势；血清 HIF-1α 水平分别为（31.462± 7.458）、（21.454±5.489）和（12.052±3.623）mg/L，亦呈逐渐下降趋势。患者组尿液中VEGF-A与HIF-1α的表达趋势与血清一致。患者组血清中VEGF-A与HIF-1α和尿液中VEGF-A与HIF-1α均呈正相关（r=0.730，P＜ 0.05；r=0.667，P＜ 0.05）；血清VEGF-A、尿液VEGF-A、血清HIF-1α 以及尿液 HIF-1α 均与给药时程呈负相关（r值分别为-0.390、-0.689、-0.806、-0.683，P 值分别 ＜ 0.05、0.01、0.05、0.01）。结论普萘洛尔治疗增殖期婴幼儿血管瘤有效可能与降低外周血清和尿液中VEGF-A和HIF-1α水平有关。

普萘洛尔；血管瘤；血管内皮生长因子A；缺氧诱导因子1α

婴幼儿血管瘤的治疗包括物理治疗和系统应用糖皮质激素，严重的病例需要用长春新碱、干扰素α和环磷酰胺，但这些疗法往往给婴儿造成严重的不良反应［1］。2008年法国Bordeaux 儿童医院的 Léauté-Labrèze 等［2］报道使用普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤取得显著疗效，但治疗机制尚不完全清楚。缺氧是血管生成反应的主要原因，也能刺激血管内皮祖细胞进一步增殖并分化成内皮细胞。而缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α） 是近年来备受关注的与血管生成有关的转录因子，被认为是肿瘤血管新生的关键因素，能诱发血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因转录，在血管生成过程中起重要作用［3］。因此，我们对婴幼儿血管瘤在普萘洛尔治疗中VEGF-A、HIF-1α表达的变化进行检测，探讨其可能的治疗机制。

一、研究对象

研究对象为新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科2010年8月至2013年2月收治的婴幼儿增殖期血管瘤患者。纳入标准：①符合血管瘤诊断标准［4］；②瘤体直径＞1 cm，每个血管瘤的体积和大小都需要进行测量；③未接受过其他治疗。排除标准：①患有过敏性哮喘、支气管炎、肺炎、支气管哮喘、房室传导阻滞、窦性心动过缓、心功能障碍、肾病及甲状腺疾病或因其他先天性疾病有口服普萘洛尔禁忌证者；②普萘洛尔过敏的患儿；③临床上考虑为脉管畸形的患者；④不愿接受口服药物治疗的患者。共收集患者30例，其中男10例，女20例，年龄2～11个月，平均年龄8个月，均属于增殖期血管瘤。颌面部27例，躯干2例，四肢1例。汉族17例，维吾尔族8例，回族3例，蒙古族2例。浅表型血管瘤11例，混合型血管瘤13例，深部型血管瘤6例。健康对照组为儿保科正常体检婴幼儿30例。本实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1.用药方法：患儿入院后进行血常规、肝肾功能、甲状腺功能、心脏超声、心电图、血压、血糖检测。对于各项检查符合要求的患儿口服普萘洛尔（天津力生制药厂生产，批号：H12020151）。治疗方案基于前期临床研究并进行优化［5］：＜3个月的患者口服剂量为0.5 mg·kg-1·d-1；3～6个月者为1 mg·kg-1·d-1； ＞ 6 个月者为 2 mg·kg-1·d-1。每次服药前、服药后 0.5、1、2、3 h 监测心率、血压。

2.临床监测：口服普萘洛尔后所有患儿入院观察3～5 d。出院后，在父母或监护人指导下口服普萘洛尔治疗。疗程4～8个月，按血管瘤消退的程度疗程最多达8个月。出院后定期随访。随访时根据患儿体重的变化调整给药剂量。如果患儿血管瘤完全消退或整个疗程达到8个月时停止服用药物。

3.VEGF-A、HIF-1α检测：分别抽取每例患儿服用普萘洛尔前、服药4周后和12周后外周静脉血2 ml、尿液5 ml。血液样本置于无菌离心管室温下静置60 min，2 000×g离心10 min分离血清，-80℃冻存。VEGF-A检测试剂盒由美国eBioscience公司提供（BMS277/2/BMS277/2TEN），HIF-1α 试剂盒由英国abcam（ab117996）公司提供。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清VEGF-A、HIF-1α浓度，具体步骤按说明书进行。采用相同方法处理和测定尿液标本。采用CurveExpert Profes-sional 1.3制作标准曲线，确定血清及尿液VEGF-A、HIF-1α水平。

4.疗效判定：治疗前及治疗4周、12周后B超测量瘤体大小。临床疗效评估采用Achauer疗效评定法［6］：Ⅰ级（差）：瘤体缩小 ＜25%；Ⅱ级（中等）：瘤体缩小26% ～50%；Ⅲ级（好）：瘤体缩小51%～75%；Ⅳ级（优）：瘤体缩小＞75%。

5.统计学分析：选用SPSS17.0统计软件进行数据处理。计量资料满足正态分布，组间比较采用两因素方差分析（检验水准α=0.05），两两比较采用LSD法。对有序的等级资料，采用Ridit分析方法，将有序等级资料转化成连续型资料，转化后采用单因素方差分析及多组间两两比较的LSD检验。对VEGF-A和HIF-1α，VEGF-A和HIF-1α与给药时程进行二元变量相关性分析。

三、结果

1.疗效评价：治疗12周后，2例疗效为优，11例好，14例中等，3例差。浅表型、混合型、深部型血管瘤治疗4周与12周后疗效差异有统计学意义（z值分别为2.014、1.969、2.25，均P＜0.05），12周后疗效优于4周后。治疗4周后，浅表型、混合型、深部型血管瘤间两两比较，疗效差异无统计学意义（均P＞0.05）；治疗12周后，浅表型与混合型（z=1.980，P＜0.05）、浅表型与深部型血管瘤（z=2.688，P＜ 0.01）疗效差异均有统计学意义，深部型与混合型血管瘤间疗效差异无统计学意义（z=1.169，P ＞ 0.05）。见表1。

表1 普萘洛尔治疗不同类型血管瘤的疗效比较 例

2.VEGF-A表达：患者组治疗前血清及尿液VEGF-A水平最高，服药4周和12周后逐渐下降，见表2。健康对照组血清中VEGF-A水平与患者组治疗前、治疗4周后、治疗12周后比较差异有统计学意义（P＜0.05）；患者组治疗前与治疗12周后比较差异有统计学意义（P＜0.05），治疗前与治疗4周后、治疗4周后与12周后比较，差异无统计学意义（均P ＞ 0.05）。

尿液中VEGF-A水平，健康对照组与患者组治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.05），与患者组治疗4周后、治疗12周后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。患者组治疗前与治疗12周后、治疗4周后与12周后比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）；治疗前与治疗4周后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.HIF-1α表达：患者组治疗前血清及尿液HIF-1α水平最高，服药4周后和12周后逐渐下降。见表2。

血清中HIF-1α的水平，健康对照组与患者组治疗前、治疗4周后比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与患者组治疗12周后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；患者组治疗前与治疗4周后、治疗12周后比较及治疗4周后与12周后比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

尿液中HIF-1α水平，健康对照组与患者组治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.05），与患者组治疗4周后、12周后比较差异无统计学意义（P＞0.05）；患者组治疗前与治疗12周后、治疗4周后与12周后比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），治疗前与治疗4周后比较差异无统计学意义（P=0.05）。

4.相关性分析：线性相关与回归分析表明，患者组血清VEGF-A与HIF-1α呈正相关（r=0.730，P＜0.05）， 尿液VEGF-A与HIF-1α 呈正相关（r=0.667，P ＜0.05）。

5.VEGF-A、HIF-1α与给药时程的相关性分析：血清VEGF-A、尿液VEGF-A、血清HIF-1α以及尿液HIF-1α均与给药时程呈负相关（r值分别为-0.390、-0.689、-0.806、-0.683，P值分别 ＜0.05、 ＜0.01、 ＜0.05、 ＜0.01）。

表2 血管瘤治疗前后血清及尿液中血管内皮生长因子A（VEGF-A）与缺氧诱导因子 1α（HIF-1α）的表达（±s）

表2 血管瘤治疗前后血清及尿液中血管内皮生长因子A（VEGF-A）与缺氧诱导因子 1α（HIF-1α）的表达（±s）

分组 例数 VEGF-A（μg/L） HIF-1α（mg/L）血清 尿液 血清 尿液健康对照组 30 268.174±95.056 52.907±14.055 10.809±1.686 2.563±0.957患者组治疗前 30 385.692±136.146 76.234±24.169 31.462±7.458 11.273±3.545治疗4周后 30 264.853±122.120 56.454±16.111 21.454±5.489 7.968±6.015治疗12周后 30 211.345±104.035 34.728±12.656 12.052±3.623 2.369±1.563 F值 4.059 9.637 36.266 14.502 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

四、讨论

本研究显示，普萘洛尔对婴幼儿血管瘤疗效明确，且治疗时间越长，治疗效果越好。治疗12周后，混合型和深部型血管瘤的疗效优于浅表型血管瘤，但深部型与混合型之间差异无统计学意义。治疗过程中没有因不良反应而退出治疗的患儿。多数血管瘤在首次治疗后24 h瘤体颜色变浅并且质地变软。治疗过程中对并发症的处理参考杨舟等［7］的方法。2例患者治疗后出现轻度腹泻，给予蒙脱石散等对症治疗后症状缓解；3例患者治疗后出现难以入眠或睡眠浅易惊醒，服药1周后上述症状自行消失。患者家长对治疗效果满意。1例患者服用普萘洛尔3个月后瘤体完全消退。然而，有些瘤体在患儿突然停药后复发，继续服用药物治疗能有效控制其增殖，停药时需告知家长缓慢逐渐减量停药。

既往研究已证实，VEGF信号转导通路在血管瘤的发生发展中起到至关重要的作用［8］。一些研究表明［9］，VEGF 在增殖期血管瘤较消退期和血管畸形组织中的表达明显增强。另一研究显示［10］，在血管瘤患者血清中VEGF浓度升高。我们发现，增殖期血管瘤患者血清中VEGF水平明显升高，与既往研究一致。而服药后4周和12周血清和尿液VEGF-A水平呈逐渐下降趋势，提示普萘洛尔通过抑制VEGF实现缩小瘤体的治疗作用。

在组织缺氧条件下［11-12］，HIF-1α转录基因可促使血管内皮细胞产生VEGF及间质细胞衍生因子，将内皮祖细胞（endothelia progenitor cells）动员到外周循环而进入外周血管组织中，通过整合进血管壁或提供生长因子两种方式来促使新生血管形成。HIF-1α在血管内皮细胞缺氧的状态下，表达明显增强，诱导VEGF基因进行转录，促使VEGF分泌增加［13］。VEGF扩散到周围组织后，引起周围内皮细胞增殖，最后导致胞外重组蛋白酶如基质金属蛋白酶分泌，调节不同的血管细胞（如内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞等），使其功能激活［14］，分化成功能性的血管，使局部缺氧状态得以改善，活化的HIF-1α浓度降低，VEGF分泌减少，成血管能力下降。所以，β肾上腺素受体阻滞剂的抗VEGF、HIF-1α活性可能会对增殖期血管瘤有明显影响。陈达等［15］研究也发现，婴幼儿血管瘤增生期血管内皮细胞和周围疏松组织细胞中HIF-1α蛋白表达水平明显增高，说明增生期血管瘤血管内皮细胞可能存在着特殊的低氧分压微环境。我们发现，血清及尿液VEGF-A与HIF-1α均呈正相关，普萘洛尔可能也是通过对两者的抑制发挥治疗作用。分析发现，随着给药时间延长，VEGF-A和HIF-1α血清及尿液浓度逐渐减少。而且，治疗后较治疗前血清及尿液HIF-1α水平明显降低，说明普萘洛尔可能是通过改善血管瘤的局部缺氧状态，进一步降低局部活化的HIF-1α浓度，使VEGF分泌减少，最终导致血管瘤生长变缓，甚至消失。

综上所述，我们推测，普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤有效，可能是通过下调HIF-1α的表达，使VEGF分泌减少，血管瘤组织成血管能力下降，血管瘤增殖受到抑制。但仍需要大样本的随机对照研究进一步明确普萘洛尔治疗机制，同时验证其安全性和有效性，了解其最佳治疗剂量和时间。

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2014-01-16）

（本文编辑：尚淑贤）

Propranolol for proliferating hemangioma:therapeutic efficacy and expressions of vascular endothelial growth factor-A and hypoxia-inducible factor 1α in patients before and after treatment

Ling Bin,Yin Xiaopeng,Liu Jie,Zhang Jing,Gong Zhongcheng,Lin Zhaoquan.Oncology Department of Oral&Maxillofacial Surgery,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University；Stomatology College of Xinjiang Medical University；Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830054,China

；Lin Zhaoquan,Email；lzqxhj@163.com

ObjectiveTo evaluate the clinical efficacy of propranolol in treating proliferating infantile haemangiomas,and to measure the expression levels of vascular endothelial growth factor-A（VEGF-A）and hypoxiainducible factor 1α （HIF-1α） in sera and urine of patients during the treatment.Methods Thirty infants with proliferating haemangiomas were treated with propranolol at doses of 0.5-2 mg/kg per day.The radius of haemangiomas was measured,and blood and urine samples were obtained from these patients before,and at 4 and 12 weeks after the beginning of treatment.Clinical efficacy was estimated according to a four-graded scale as well as the feedback from parents of these patients.Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was performed to determine the serum and urine concentrations of VEGF-A and HIF-1α.Thirty check-up infants collected from the Department of Child Health Care served as the healthy controls.Statistical analysis was done by two-way analysis of variance followed by the least significant difference（LSD） test.ResultsAfter 12 weeks of treatment,clinical response was excellent in 2 patients,good in 11,moderate in 14,and poor in 3.The serum levels of VEGF-A and HIF-1α were（268.174±95.056）μg/L and （10.809±1.686）mg/L respectively in the control group,sequentially decreased in the patients from baseline to 4 and 12 weeks after the beginning of treatment（VEGF-A；（385.692±136.146） vs.（264.853 ± 122.12） vs.（211.345 ± 104.035） μg/L；HIF-1α；（31.462 ± 7.458） vs.（21.454 ± 5.489）vs.（12.052 ± 3.623） mg/L）.The trend in expression changes of VEGF-A and HIF-1α in urine samples was similar to that in blood samples in these patients.Positive correlation was observed between the expression level of VEGF-A and HIF-1α in sera（r=0.730,P＜0.05）and urine（r=0.667,P＜0.05）of these patients.Moreover,the levels of serum VEGF-A,urine VEGF-A,serum HIF-1α and urine HIF-1α were all negatively correlated with the time course following propranolol administration （r=-0.390,-0.689,-0.806,-0.683,P＜ 0.05,0.01,0.05,0.01 respectively）.ConclusionPropranolol is effective for the treatment of proliferating infantile haemangiomas,likely by reducing serum and urinary concentrations of VEGF-A and HIF-1α in children.

Propranolol；Hemangioma；Vascular endothelial growth factor A；Hypoxia-inducible factor 1α

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.017

新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目（2013211A080）

830054乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所

林兆全，Email：lzqxhj@163.com