高压氧对兔耳增生性瘢痕形成过程中缺氧诱导因子1α和胰岛素样生长因子Ⅰ受体表达的影响

任纪祯 陈振雨 杨廷 万金娥 赵明

高压氧对兔耳增生性瘢痕形成过程中缺氧诱导因子1α和胰岛素样生长因子Ⅰ受体表达的影响

任纪祯 陈振雨 杨廷 万金娥 赵明

目的探讨高压氧对兔耳增生性瘢痕的形成及瘢痕组织中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-1R）表达的影响。方法选取20只新西兰大白兔建立兔耳瘢痕模型，随机分成实验组和对照组，实验组根据给予高压氧时间不同分为7 d、14 d、21 d及28 d组，每组4只共48个创面，实验组术后立即给予高压氧处理，对照组处于常氧压空气环境中。术后第29天切取瘢痕组织进行苏木精-伊红（HE）染色，观察形态学差异，计算瘢痕增生指数；免疫组化法检测HIF-1α、IGF-1R的表达。结果HE染色可见实验组成纤维细胞数量及胶原纤维含量较对照组明显减少。对照组瘢痕增生指数为4.28±0.22，7 d、14 d、21 d及28 d实验组分别为3.64±0.29、3.46±0.21、3.29±0.21、3.16±0.15，各组间差异有统计学意义（F=77.70，P＜0.05）。免疫组化检测可见，各实验组HIF-1α、IGF-1R的表达量均较对照组显著降低（P＜0.01），14 d组两因子表达量较7 d组、21 d组较14 d组减少（均P＜0.05），28 d组与21 d组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论高压氧可降低兔耳瘢痕组织中HIF-1α、IGF-1R的表达，对兔耳增生性瘢痕的形成有明显抑制作用。

高压氧；瘢痕；缺氧诱导因子1，α亚基；胰岛素样生长因子-I受体

缺氧是影响瘢痕增生的的重要因素之一，Kischer等［1］研究发现，低氧在病理性瘢痕的形成过程中起着重要作用。低氧不但能调控瘢痕中成纤维细胞的活性、胶原的合成与降解，还能影响一些生长因子如缺氧诱导因子1（HIF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子 β1（TGFβ1）等的分泌。HIF-1是缺氧特异感受因子，能对缺氧产生适应性反应，减轻缺氧造成的损害，它随缺氧程度变化而变化［2-4］，该因子可调节多种靶细胞因子如血管内皮生长因子、促红细胞生成素等。胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-1R）介导的信号通路与瘢痕的形成密切相关，其不但能诱导成纤维细胞合成和分泌胶原等细胞外基质，还能抑制细胞凋亡，从而使瘢痕中成纤维细胞获得持久增殖和分泌的能力，影响创面愈合后组织改建［5-6］。高压氧治疗能使创面局部血氧含量增高，改善组织缺氧状态，增加组织供氧，促进创面愈合［7-8］。本实验拟在瘢痕形成过程中给予高压氧治疗，并观察高压氧对病理性瘢痕中HIF-1α、IGF-1R表达的影响，探讨高压氧在瘢痕形成过程中可能发挥的作用。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：健康新西兰大白兔20只，体重2.0～2.5 kg，兔耳健全，雌雄不拘，由青岛市实验动物中心提供，许可证号 SCXK（鲁）2009～0007。

2.实验材料：兔抗兔HIF-1α单克隆抗体、兔抗兔IGF-lR单克隆抗体产自北京博奥森生物技术有限公司；SABC试剂盒、DAB显色试剂盒产自北京中杉金桥生物技术有限公司。

二、方法

1.兔耳增生性瘢痕模型的建立：选取20只新西兰大耳白兔，适应性饲养1周后，参照李荟元［9］方法制作瘢痕模型，并加以改良，用盐酸氯胺酮30 mg/kg、地西泮5 mg/kg肌内注射麻醉成功后，固定于操作台上，兔耳腹侧面皮肤聚维酮碘消毒，严格无菌操作下，在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管作直径为1 cm大小创面，每耳6处，创面间隔1 cm以上，去掉兔耳全层皮肤，并用刮勺彻底刮除软骨膜，压迫止血。模型制备成功后，采取单兔单笼标准条件下饲养。将兔随机分成实验组和对照组，实验组根据给予高压氧的时间不同分为7 d、14 d、21 d及28 d组，每组4只共48个创面。

2.高压氧处理：实验组于术后立即置于DS-Ⅱ型实验动物加压舱，纯氧洗舱5 min，升压10 min至0.1 MPa后稳压，吸纯氧60 min，减压10 min。实验组按分组不同分别行高压氧治疗7 d、14 d、21 d及28 d，每天同一时间治疗1次。对照组处于常氧压空气环境中。

3.标本取材及处理：于模型制备后29 d，在同样麻醉条件下统一切取实验组和对照组瘢痕组织及周围1 mm正常组织，4%甲醛固定，常规石蜡包埋，苏木精-伊红（HE）染色、免疫组化染色，光镜下观察HE染色切片，用测微尺测出瘢痕最高点至耳软骨表面的垂直厚度（a）、瘢痕周边正常皮肤至耳软骨表面的垂直厚度（b），瘢痕增生指数（hypertrophic index，HI）=a/b。蜡块包埋时，尽量让瘢痕的高点竖直线与蜡块相平行，均由同一医师切片，切出一个最大面，然后以此最大面完成瘢痕指数的测量计算。

4.结果判定：HIF-1α、IGF-1R阳性细胞半定量（参照徐少骏方法［10］）玻片置于相同强度光线下观察，按染色的深浅（信号强度）分为3级：棕黑色为强阳性“+++”，棕黄色为阳性“++”，浅棕色为弱阳性“+”。在表皮随机取5个位置，每个位置从表皮层到真皮深层根据组织厚度取4～6个高倍视野，每个视野随机观察50个细胞，将阳性细胞选定在各个级别中，用权重方法将全部阳性信号进行量化，即“+++”乘 3，“++”乘 2，“+”乘 1。权重量化的数值反映了该位置的信号强度，取5个位置的平均值作为该标本的相对信号强度。

5.统计学处理：采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，所有数据采用±s表示，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、形态学观察

7 d、14 d、21 d及28 d实验组和对照组创面在上皮化后均逐渐形成不同程度瘢痕增生，实验组瘢痕较对照组明显减轻。对照组瘢痕增生明显，高出皮肤表面，充血呈紫红色，质硬；实验组瘢痕增生不明显，瘢痕体积小，色白，质软。见图1。

二、HE染色结果

对照组瘢痕组织成纤维细胞数目多、核大，毛细血管增生明显，胶原纤维致密粗大，排列紊乱；各实验组瘢痕均较对照组薄，成纤维细胞数目减少，胶原纤维减少，较疏松，可见少量毛细血管，以21、28 d组较为明显。见图2。

三、HI

各实验组HI值均比对照组低（均P＜0.05），7 d、14 d、21 d组HI值随高压氧治疗时间的延长逐渐降低，14 d组低于7 d组，21 d组低于14 d组，差异有统计学意义（均P＜0.05），21 d组与28 d组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 兔耳增生性瘢痕形成第29天形态学观察：实验组和对照组兔耳创面都形成了不同程度的增生性瘢痕 1a：对照组瘢痕增生明显，高出皮肤表面，充血呈红色，触之质硬；1b～1e：分别为7、14、21、28 d组，与对照组相比，各实验组瘢痕增生不明显，瘢痕体积较对照组小，颜色较浅，质软

图2 兔耳增生性瘢痕形成第29天组织学表现（HE×100） 2a：对照组瘢痕内大量成纤维细胞，胶原纤维致密粗大，排列紊乱；2b～2e：分别为7、14、21、28 d实验组，其瘢痕均较对照组薄，成纤维细胞数目减少，胶原纤维少，排列较疏松

图3 兔耳增生性瘢痕形成第29天胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-1R）的表达（免疫组化 ×100） 3a：对照组可见IGF-1R表达；3b～3e：分别为7、14、21、28 d组，IGF-1R表达较对照组明显减弱

图4 兔耳增生性瘢痕形成第29天缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达（免疫组化×100） 4a：对照组可见HIF-1α表达； 4b ～ 4e：分别为7、14、21、28 d实验组，HIF-1α表达较对照组明显减弱

四、HIF-1α、IGF-1R 的表达

实验组和对照组均可见HIF-1α、IGF-1R表达，见图3、4。各实验组HIF-1α、IGF-1R的表达量均较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），14 d组两因子表达量较7 d组显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01），21 d组两因子的表达量较14 d组减少（P＜0.05），28 d组两因子的表达量与21 d组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

讨 论

研究表明，兔耳瘢痕造模成功后28 d左右瘢痕增生达到高峰［9］，此后28～56 d瘢痕处于增生稳定期，在该时间内既可观察药物对瘢痕继续增生的抑制作用，又可观察药物等因素对已形成的固有瘢痕的影响［11-12］。本研究在造模后立即给予高压氧干预，主要观察高压氧对兔耳瘢痕形成过程中早期的影响，因此选择在高压氧开始干预后的第29天统一取材来观察高压氧抑制瘢痕的效果。

表1 高压氧对各组兔耳瘢痕增生指数、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-1R）表达的影响（±s）

表1 高压氧对各组兔耳瘢痕增生指数、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-1R）表达的影响（±s）

注： 与对照组比较，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01； 与 7 d组比较，c：P ＜0.05，d：P ＜ 0.01；与 14 d 组比较，e：P ＜ 0.05

组别 创面数 瘢痕增生指数 HIF-1α IGF-1R对照组 48 4.28±0.22 46.86±4.21 56.82±4.80实验组7 d组 48 3.64±0.29a 38.33±3.16b47.38±3.67b 14 d组 48 3.46±0.21c 31.85±2.55d42.92±2.60d 21 d组 48 3.29±0.21e 29.77±1.89e39.79±2.06e 28 d组 48 3.16±0.15 28.06±1.67 37.78±2.22 F值 77.70 146.01 110.66 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

黎国屏和李清怀［13］在研究高压氧对烧伤创面的影响时发现，高压氧能改善组织低氧，使创面愈合速度加快，减少瘢痕组织形成。Al-Waili等［14］在研究高压氧和恶性肿瘤的关系时发现，高压氧能抑制乳腺癌动物模型中TGFβ1和IGF-1的表达。本研究发现，各实验组HI值均比对照组低；组织形态学上，与对照组比较，各实验组瘢痕增生不明显，瘢痕体积小，色白，质软，HE结果示各实验组瘢痕均较对照组薄，成纤维细胞数目减少，胶原纤维减少，较疏松，以21 d、28 d组较为明显；免疫组织化学检测显示，各实验组HIF-1α、IGF-1R的表达量均较对照组显著降低。此结果与 Romero-Valdovinos等［15］的研究结果基本一致，即高压氧不但可以降低瘢痕中成纤维细胞的增殖，而且能降低瘢痕中TGF-β mRNA与IGF mRNA的表达，因此，高压氧不但调控细胞活性，影响胶原的合成与降解，而且还能调节细胞因子的表达来进一步影响瘢痕形成。

本研究发现，HIF-1α及IGF-1R在14 d组表达量较7 d组显著减少，21 d组较14 d组减少，28 d组与21 d组差异无统计学意义，表明尽早应用高压氧干预可能更有利于创面愈合。

本研究结果初步表明，兔耳瘢痕形成过程中早期给予高压氧治疗可降低增生性瘢痕中HIF-1α、IGF-1R的表达，抑制增生性瘢痕的形成，推测其机制可能与以下因素有关：瘢痕形成早期，高压氧通过改善组织氧张力，改善瘢痕的缺氧状态，同时促进损伤血管的修复及促进新血管的生成，增加组织氧供，促进肉芽组织的生成，加快创面愈合，并且高压氧下调IGF-1R、HIF-1α等与瘢痕增生密切相关的生长因子。IGF-1R表达降低能抑制成纤维细胞的生长增殖，减少胶原的合成、分泌，HIF-1α表达降低通过调节一系列靶基因来进一步抑制成纤维细胞的增殖及血管生成等来抑制瘢痕的增殖。

[1]Kischer CW,Shetlar MR,Shetlar CL.Alteration of hypertrophic scars induced by mechanical pressure[J].Arch Dermatol,1975,111（1）；60-64.

[2]尹光文,李敏,张守民.血管内皮生长因子、缺氧诱导因子1α及基质金属蛋白酶9在尖锐湿疣组织中的表达[J].中华皮肤科杂志,2007,40（5）；280-282.

[3]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol,1992,12（12）；5447-5454.

[4]Semenza GL.Expression of hypoxia-inducible factor 1；mechanisms and consequences[J].Biochem Pharmacol,2000,59（1）；47-53.

[5]陈晓栋,方方,赵亮,等.胰岛素样生长因子-Ⅰ受体蛋白在瘢痕疙瘩中的表达[J].中华皮肤科杂志,2004,37（12）；734.

[6]Daian T,Ohtsuru A,Rogounovitch T,et al.Insulin-like growth factor-I enhances transforming growth factor-beta-induced extracellular matrix protein production through the P38/activating transcription factor-2 signaling pathway in keloid fibroblasts[J].J Invest Dermatol,2003,120（6）；956-962.

[7]刘子生,卢培刚,袁绍纪,等.高压氧对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响[J].中华神经外科疾病研究杂志,2009,8（6）；484-487.

[8]梁伟中.高压氧治疗慢性创面的研究进展[J].中国美容医学,2010,19（11）；1737-1740.

[9]李荟元.兔耳瘢痕模型的应用现状[J].中国美容医学,2011,20（7）；1174-1178.

[10]徐少骏,鲍卫汉,陈东明,等.增殖瘢痕成纤维细胞接触后增殖及生物合成特性对异常瘢痕形成的机理[J].中华整形外科杂志,2002,18（2）；86-88.

[11]刘建波,李荟元.TGFβ1mRNA在兔耳瘢痕中的表达及其意义[J].第四军医大学学报,2000,21（4）；s46-s48.

[12]李荟元.创伤研究动物模型-兔耳瘢痕模型的建立与应用[M].西安；第四军医大学出版社,2005；42-43.

[13]黎国屏,李清怀.高压氧对烧伤创面的影响[J].河北医科大学学报,1999,20（2）；108.

[14]Al-Waili NS,Butler GJ,Beale J,et al.Hyperbaric oxygen and malignancies；a potential role in radiotherapy,chemotherapy,tumor surgery and phototherapy[J].Med Sci Monit,2005,11（9）；RA279-RA289.

[15]Romero-Valdovinos M,Cárdenas-Mejía A,Gutiérrez-Gómez C,et al.Keloid skin scars；the influence of hyperbaric oxygenation on fibroblast growth and on the expression of messenger RNA for insulin like growth factor and for transforming growth factor[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2011,47（7）；421-424.

2013-12-05）

（本文编辑：尚淑贤）

Effects of hyperbaric oxygen on the expressions of hypoxia-inducible factor 1α and insulin-like growth factor-1 receptor in the formation of hyperplastic scar in rabbit ears

Ren Jizhen,Chen Zhenyu,Yang Ting,Wan Jin′e,Zhao Ming.Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China

；Chen Zhenyu,Email；czy.plastic@126.com

ObjectiveTo evaluate the effects of hyperbaric oxygen on the expressions of hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α） and insulin-like growth factor-1 receptor （IGF-1R） in the formation of hyperplastic scar in rabbit ears.MethodsThe ears of 20 New Zealand rabbits were used to construct an animal model for hyperplastic scar by operation.After the establishment of scar models,the rabbits were randomly divided into 4 experimental groups and one control group with 4 mice （48 wound surfaces） in each group.The mice in the 4 experimental groups were treated with hyperbaric oxygen for 7,14,21 and 28 days,respectively,and those in the control group remained in normoxic environment after operation.Scar tissues were resected from all the rabbit ears on day 29 after operation.Hematoxylin and eosin （HE）staining was conducted for the observation of morphological changes and calculation of scar elevation index,and immunohistochemistry to measure the expressions of HIF-1α and IGF-1R.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by least significant differencet-test.ResultsHE staining showed that both the number of fibroblasts and amount of collagen fibers were significantly reduced in the experimental groups compared with the control group.Scar elevation index was 4.28±0.22 in the control group,3.64±0.29,3.46±0.21,3.29±0.21,3.16±0.15 in the 7-,14-,21-and 28-day experimental groups respectively,with significant differences among these groups （F=77.70,P＜ 0.05）.The expressions of HIF-1α and IGF-1R were significantly lower in these experimental groups than in the control group （allP＜0.01）,lower in the 14-day group than in the 7-day group（P＜0.05）,and lower in the 21-day group than in the 14-day group（P＜0.05）,with no significant differences between the 28-day group and 21-day group （bothP ＞ 0.05）.ConclusionHyperbaric oxygen can effectively down-regulate the expressions of HIF-1α and IGF-1R in scar tissue,and significantly inhibit the formation of hyperplastic scar in rabbit ears.

Hyperbaric oxygenation；Cicatrix；Hypoxia-inducible factor 1,alpha subunit；Receptor,IGF type 1

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.008

山东省科技发展计划项目（2011YD18036）

266003青岛大学医学院附属医院

陈振雨，Email：czy.plastic@126.com