龙藤筋骨片治疗急性软组织损伤的机制探讨

汪涛胡卫东钟才进赵雁平刘辉曾凡波

(1.广州军区武汉疗养院，430074；2.广州军区武汉总医院，430072；3.华中科技大学同济医学院药学院，430030)

软组织损伤临床上主要为外力作用下皮肤、皮下深筋膜、韧带、关节囊、肌肉、肌腱、神经及血管受到的闭合性损伤和病理性损害，临床表现为局部的疼痛、肿胀、功能障碍等，中医辨证为瘀证，以活血化瘀、清热凉血为主。龙藤筋骨片具有强筋壮骨、活血通络的作用。本实验以大鼠软组织损伤作为实验模型，观察龙藤筋骨片治疗急性软组织损伤的作用，并检测龙藤筋骨片提取物对白细胞介素-1β(IL-1β)的影响，探讨其治疗软组织损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SD白色大鼠90只，雌雄各半[SPF级，190～210 g，湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005]，实验前适应性喂养1周。

1.2 实验设备 全自动多功能酶标仪(Wellsacn MK3型，北京炳洋科技有限公司)；80-2台式低速离心机(上海手术器械厂)；ALC-210.3电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.3 药物及试剂 龙藤筋骨片，由本院制剂室提供，制剂批文：广制字(2011)F03001(批号：130306)；龙藤筋骨片提取物：取龙藤筋骨片药粉适量，70%乙醇提取2次，第1次10倍量溶剂，第2次6倍量，浓缩后加70%乙醇调整至1 g，浸膏相当于2 g药材。阳性对照药物：双氯芬酸二乙胺乳胶剂，北京诺华制药有限公司生产，规格：20 g/支，批号：X1600。IL-1β测定试剂盒：购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 实验造模 参照周国林[1]的造模方法将SD大鼠90只，雌雄各半，实验前24 h用10%硫化钠对大鼠臀部及大腿后侧脱毛，并做好标记。将大鼠右下肢平放，固定于软组织打击器底座台上，将50 g打击锤拉至10 cm高度，松开打击锤，自由落下，连击5次，造成面积约1 cm2大小有明显皮下出血及肿胀的非开放性软组织损伤模型[2]。打击后大鼠出现单侧后肢跛行，肉眼即见打击部位青紫、瘀血、肿胀，说明造模成功。局部皮肤破损以及检查发现有骨折征象者予以排除。

1.5 动物分组 造模成功后所有大鼠在同一条件下(室温20～25℃，相对湿度4%左右)，用普通饲料喂养，自由饮水。90只大鼠随机分为：空白对照组(A组)，模型对照组(B组)，阳性药组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂，C组)、龙藤筋骨片低剂量组(以下简称低剂量组，龙藤筋骨片药粉0.20 g/kg，加入一定量透皮吸收剂，D组)和龙藤筋骨片高剂量组(以下简称高剂量组，龙藤筋骨片药粉0.80 g/kg，加入一定量透皮吸收剂，E组)，每组18只动物[3]。分5组后再按随机数字表法每组再随机分为3个时相点组(1 d组、3 d组、5 d组，每组6只)。

1.6 实验方法 A组与B组外敷无药等容量乳膏基质，用绷带包扎固定。C组与D、E组分别外敷等容量双氯芬酸二乙胺乳胶剂或龙藤筋骨片药粉＋稀释剂，涂布面积以超过受损区面积一半以上为度，外用卫生胶布固定、包扎。每天换药1次，连续用药5 d。于造模后1 d、3 d、5 d分3批处死大鼠，用手术刀切开大鼠受打击部位皮肤，分离皮下组织，切取肿胀明显部位的组织片40 mg，将组织片用组织匀浆器进行匀浆，采用ELISA法测组织中IL-1β含量，操作步骤严格按照试剂盒说明进行[4]。

2 结果

2.1 龙藤筋骨片对软组织损伤模型大鼠损伤症候指数的影响 大鼠经打击后伤肢迅速出现肿胀、皮肤瘀斑及皮下出血现象，说明造模成功。

2.2 龙藤筋骨片对血浆IL-1β水平的影响 于造模后1 d、3 d及5 d时取血，测定血浆中IL-1β水平，各组模鼠损伤局部软组织IL-1β含量在伤后各时相均明显高于空白组(P＜0.01)，龙藤筋骨片低、高剂量给药组与双氯芬酸二乙胺乳胶剂组均能降低损伤局部软组织IL-1β含量，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05，表1)。

表1 各组动物受伤局部组织匀浆IL-1β含量比较(ng/mL±s)

表1 各组动物受伤局部组织匀浆IL-1β含量比较(ng/mL±s)

注：与A组比较，△P＜0.05；与B组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

组别 1 d 3 d 5 d A组 1.208 4±0.576 9 B组 16.514 3±1.702 6△ 18.822 5±2.026 4 13.145 6±0.801 4 C组 13.124 1±1.365 7△* 14.368 5±1.124 9# 10.631 8±1.632 2#D组 9.875 6±0.698 2△* 12.913 7±2.364 1* 7.433 5±1.853 7#E组 9.823 3±2.348 6△* 14.173 0±4.865 7* 8.311 4±2.795 2#

3 讨论

IL-1β是一种强效促炎症细胞因子，软组织中的IL-1β主要由单核巨噬细胞产生[5]，正常情况下局部软组织中IL-1β的水平极低。软组织受伤后，促炎性细胞因子IL-1β释放到受伤局部，可促进炎性细胞发挥作用[6]。本实验结果表明，龙藤筋骨片可显著抑制IL-1β的水平的升高，与模型组比较，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。由此推测，龙藤筋骨片可能是通过降低局部组织中IL-1β的水平从而抑制炎性细胞的作用，减轻炎症反应。

急性软组织损伤的中医病机是气滞血瘀，不通致病。龙藤筋骨片由熟地、当归、骨碎补、牛膝、鸡血藤、羌独活、海桐皮等中药组成。熟地甘、微温，入心、肝、肾经，滋阴补血，治阴虚血少，本方用其填骨髓，强筋骨，长肌肉。当归味苦、温、无毒，入肝、心、脾经，补血、和血，治血虚痿痹、跌扑损伤，本方用其和血止痛。骨碎补味苦、温、无毒，入肾、心经，补肾、活血、续伤。文献[7-8]报道，骨碎补具有促进骨折愈合和补肾强骨的功效，其中，柚皮苷是其接骨疗伤的主要活性成分；Jeong等[9]的研究结果显示，骨碎补提取物能够促进成骨细胞增殖和分化，并可抑制骨吸收。《开宝本草》记载骨碎补“主破血，止血，补伤折。”《圣惠方》有骨碎补散，治跌打损伤，消瘀止痛。牛膝酸平、无毒，入肝、肾经，补肝肾、强筋骨、活血去瘀。《名医别录》记载牛膝“主脚中酸痛，不欲践地。”相关研究[10]结果显示，牛膝具有扩张下肢血管和改善血液黏稠度和微循环的作用，从而达到消肿止痛的目的。鸡血藤苦、微甘、温，入肝、肾经，活血舒筋，消肿止痛。《饮片新参》记载鸡血藤“去瘀血，生新血，流利经脉。治风血痹症。”羌活味苦辛、无毒，入膀胱、肾经，散寒祛湿、利关节，治风寒湿痹，项强筋急。文献报道[11]，羌活能解热镇痛、抗炎，增加血流量，缓解疼痛和抗凝。独活甘、微温、无毒，入膀胱、肾经，去风胜湿、散寒止痛。《备急千金要方》有独活寄生汤，能缓解疼痛、改善活动受限。药理研究[12]结果显示，独活可扩张血管、减少渗出，有镇痛抗炎的作用，与非甾体类抗炎药疗效相当，但无非甾体类抗炎药所致的溃疡、心慌、高血压等不良反应，安全有效，且费用低廉。海桐皮味苦、平、无毒，入肝、肾经，祛风通络治痹痛。《岭南采药录》记载海桐皮“生肌，止痛，散血，凉皮肤，敷跌打。”《小儿卫生总微论方》有海桐皮散，治脚挛不能伸举。本方骨碎补，牛膝，鸡血藤主要用于活血消肿，而羌独活，海桐皮用于活血止痛。局部外敷调药用了食醋，中医学认为，食醋外敷有活血、消肿、止痛的作用，常用醋调中药外敷治疗腰腿扭伤、骨折、软组织损伤，能迅速消肿止痛。诸药合用，具有补益肝肾、活血化淤、行气止痛之功；内外兼治，增强了药效，从而改善血液循环、消炎止痛。

[1]周国林，姚全胜.一种动物软组织损伤的实验方法[J].中国药理学通报，1991，7(5)：396-399.

[2]李卫星，谭大琦，李秋华，等.消瘀止痛膏对大鼠急性软组织损伤的治疗作用[J].中医正骨，2000，12(11)：11.

[3]李敏，何朝勇，陈丽华，等.奇正消痛贴膏治疗急性软组织损伤实验研究及其机制探讨[J].中华中医药杂志，2009，24(9)：1241-1243.

[4]董静，叶锐彬，温呈洪.郑氏伤科活络膏对急性软组织损伤动物模型抗炎机制的研究[J].辽宁中医药大学学报，2009，11(11)：200-202.

[5]Dianrello CA.The biological properties of interleukin-1[J].European Cytokine Network，1994，5(6)：517-531.

[6]Martin C，Boisson C，Haccoun M，et al.Patterns of cytokine evolution(tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6)after septic shock，hemorrhagic shock，and severe trauma[J].Critical Care Medicine，1997，25(11)：1812-1819.

[7]范婧蓉，韩博，李禹涛，等.骨碎补水提液对大鼠成骨细胞的影响[J].中国兽医杂志，2009，45(2)：13-15．

[8]高颖，王新峦，王乃利，等.骨碎补中的化学成分[J].中国药物化学杂志，2008，18(4)：284-287.

[9]Jeong JC，Lee JW，Yoon CH，et al.Stimulative effects of Drynariae Rhizoma extracts on the proliferation and differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].J Ethnopharmacology，2005，96(3)：489-495.

[10]孙备，吕凌，陆忠祥，等.三妙丸中牛膝对关节炎大鼠引药作用的机制研究[J].中国中药杂志，2008，33(24)：2949.

[11]马玉林，李建民，马莉，等.药用植物羌活的研究进展[J].安徽农业科学，2010，38(24)：13092-13093.

[12]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977：1705.