汪涛胡卫东钟才进赵雁平刘辉曾凡波
(1.广州军区武汉疗养院,430074;2.广州军区武汉总医院,430072;3.华中科技大学同济医学院药学院,430030)
软组织损伤临床上主要为外力作用下皮肤、皮下深筋膜、韧带、关节囊、肌肉、肌腱、神经及血管受到的闭合性损伤和病理性损害,临床表现为局部的疼痛、肿胀、功能障碍等,中医辨证为瘀证,以活血化瘀、清热凉血为主。龙藤筋骨片具有强筋壮骨、活血通络的作用。本实验以大鼠软组织损伤作为实验模型,观察龙藤筋骨片治疗急性软组织损伤的作用,并检测龙藤筋骨片提取物对白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,探讨其治疗软组织损伤的机制。
1.1 实验动物 选用SD白色大鼠90只,雌雄各半[SPF级,190~210 g,湖北省实验动物研究中心,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005],实验前适应性喂养1周。
1.2 实验设备 全自动多功能酶标仪(Wellsacn MK3型,北京炳洋科技有限公司);80-2台式低速离心机(上海手术器械厂);ALC-210.3电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
1.3 药物及试剂 龙藤筋骨片,由本院制剂室提供,制剂批文:广制字(2011)F03001(批号:130306);龙藤筋骨片提取物:取龙藤筋骨片药粉适量,70%乙醇提取2次,第1次10倍量溶剂,第2次6倍量,浓缩后加70%乙醇调整至1 g,浸膏相当于2 g药材。阳性对照药物:双氯芬酸二乙胺乳胶剂,北京诺华制药有限公司生产,规格:20 g/支,批号:X1600。IL-1β测定试剂盒:购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.4 实验造模 参照周国林[1]的造模方法将SD大鼠90只,雌雄各半,实验前24 h用10%硫化钠对大鼠臀部及大腿后侧脱毛,并做好标记。将大鼠右下肢平放,固定于软组织打击器底座台上,将50 g打击锤拉至10 cm高度,松开打击锤,自由落下,连击5次,造成面积约1 cm2大小有明显皮下出血及肿胀的非开放性软组织损伤模型[2]。打击后大鼠出现单侧后肢跛行,肉眼即见打击部位青紫、瘀血、肿胀,说明造模成功。局部皮肤破损以及检查发现有骨折征象者予以排除。
1.5 动物分组 造模成功后所有大鼠在同一条件下(室温20~25℃,相对湿度4%左右),用普通饲料喂养,自由饮水。90只大鼠随机分为:空白对照组(A组),模型对照组(B组),阳性药组(双氯芬酸二乙胺乳胶剂,C组)、龙藤筋骨片低剂量组(以下简称低剂量组,龙藤筋骨片药粉0.20 g/kg,加入一定量透皮吸收剂,D组)和龙藤筋骨片高剂量组(以下简称高剂量组,龙藤筋骨片药粉0.80 g/kg,加入一定量透皮吸收剂,E组),每组18只动物[3]。分5组后再按随机数字表法每组再随机分为3个时相点组(1 d组、3 d组、5 d组,每组6只)。
1.6 实验方法 A组与B组外敷无药等容量乳膏基质,用绷带包扎固定。C组与D、E组分别外敷等容量双氯芬酸二乙胺乳胶剂或龙藤筋骨片药粉+稀释剂,涂布面积以超过受损区面积一半以上为度,外用卫生胶布固定、包扎。每天换药1次,连续用药5 d。于造模后1 d、3 d、5 d分3批处死大鼠,用手术刀切开大鼠受打击部位皮肤,分离皮下组织,切取肿胀明显部位的组织片40 mg,将组织片用组织匀浆器进行匀浆,采用ELISA法测组织中IL-1β含量,操作步骤严格按照试剂盒说明进行[4]。
2.1 龙藤筋骨片对软组织损伤模型大鼠损伤症候指数的影响 大鼠经打击后伤肢迅速出现肿胀、皮肤瘀斑及皮下出血现象,说明造模成功。
2.2 龙藤筋骨片对血浆IL-1β水平的影响 于造模后1 d、3 d及5 d时取血,测定血浆中IL-1β水平,各组模鼠损伤局部软组织IL-1β含量在伤后各时相均明显高于空白组(P<0.01),龙藤筋骨片低、高剂量给药组与双氯芬酸二乙胺乳胶剂组均能降低损伤局部软组织IL-1β含量,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05,表1)。
表1 各组动物受伤局部组织匀浆IL-1β含量比较(ng/mL±s)
表1 各组动物受伤局部组织匀浆IL-1β含量比较(ng/mL±s)
注:与A组比较,△P<0.05;与B组比较,*P<0.05,#P<0.01
组别 1 d 3 d 5 d A组 1.208 4±0.576 9 B组 16.514 3±1.702 6△ 18.822 5±2.026 4 13.145 6±0.801 4 C组 13.124 1±1.365 7△* 14.368 5±1.124 9# 10.631 8±1.632 2#D组 9.875 6±0.698 2△* 12.913 7±2.364 1* 7.433 5±1.853 7#E组 9.823 3±2.348 6△* 14.173 0±4.865 7* 8.311 4±2.795 2#
IL-1β是一种强效促炎症细胞因子,软组织中的IL-1β主要由单核巨噬细胞产生[5],正常情况下局部软组织中IL-1β的水平极低。软组织受伤后,促炎性细胞因子IL-1β释放到受伤局部,可促进炎性细胞发挥作用[6]。本实验结果表明,龙藤筋骨片可显著抑制IL-1β的水平的升高,与模型组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。由此推测,龙藤筋骨片可能是通过降低局部组织中IL-1β的水平从而抑制炎性细胞的作用,减轻炎症反应。
急性软组织损伤的中医病机是气滞血瘀,不通致病。龙藤筋骨片由熟地、当归、骨碎补、牛膝、鸡血藤、羌独活、海桐皮等中药组成。熟地甘、微温,入心、肝、肾经,滋阴补血,治阴虚血少,本方用其填骨髓,强筋骨,长肌肉。当归味苦、温、无毒,入肝、心、脾经,补血、和血,治血虚痿痹、跌扑损伤,本方用其和血止痛。骨碎补味苦、温、无毒,入肾、心经,补肾、活血、续伤。文献[7-8]报道,骨碎补具有促进骨折愈合和补肾强骨的功效,其中,柚皮苷是其接骨疗伤的主要活性成分;Jeong等[9]的研究结果显示,骨碎补提取物能够促进成骨细胞增殖和分化,并可抑制骨吸收。《开宝本草》记载骨碎补“主破血,止血,补伤折。”《圣惠方》有骨碎补散,治跌打损伤,消瘀止痛。牛膝酸平、无毒,入肝、肾经,补肝肾、强筋骨、活血去瘀。《名医别录》记载牛膝“主脚中酸痛,不欲践地。”相关研究[10]结果显示,牛膝具有扩张下肢血管和改善血液黏稠度和微循环的作用,从而达到消肿止痛的目的。鸡血藤苦、微甘、温,入肝、肾经,活血舒筋,消肿止痛。《饮片新参》记载鸡血藤“去瘀血,生新血,流利经脉。治风血痹症。”羌活味苦辛、无毒,入膀胱、肾经,散寒祛湿、利关节,治风寒湿痹,项强筋急。文献报道[11],羌活能解热镇痛、抗炎,增加血流量,缓解疼痛和抗凝。独活甘、微温、无毒,入膀胱、肾经,去风胜湿、散寒止痛。《备急千金要方》有独活寄生汤,能缓解疼痛、改善活动受限。药理研究[12]结果显示,独活可扩张血管、减少渗出,有镇痛抗炎的作用,与非甾体类抗炎药疗效相当,但无非甾体类抗炎药所致的溃疡、心慌、高血压等不良反应,安全有效,且费用低廉。海桐皮味苦、平、无毒,入肝、肾经,祛风通络治痹痛。《岭南采药录》记载海桐皮“生肌,止痛,散血,凉皮肤,敷跌打。”《小儿卫生总微论方》有海桐皮散,治脚挛不能伸举。本方骨碎补,牛膝,鸡血藤主要用于活血消肿,而羌独活,海桐皮用于活血止痛。局部外敷调药用了食醋,中医学认为,食醋外敷有活血、消肿、止痛的作用,常用醋调中药外敷治疗腰腿扭伤、骨折、软组织损伤,能迅速消肿止痛。诸药合用,具有补益肝肾、活血化淤、行气止痛之功;内外兼治,增强了药效,从而改善血液循环、消炎止痛。
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