脓毒症大鼠肝脏组织中免疫相关基因表达的改变

毛莹莹，王东强，李志军

(1天津医科大学第一临床学院，天津300070;2天津市第一中心医院)

脓毒症属于多基因疾病，可通过一系列复杂且逐级放大的全身炎症反应造成机体重要脏器的损伤，其中肝脏是脓毒症时最易受损的器官之一［1］。传统的检测方法不仅费时、费力，而且很难明确多基因的表达变化及其相互作用关系，而应用基因芯片技术则弥补了上述不足，为探讨脓毒症的分子机制提供了强有力的工具。基因芯片是将许多特定的基因片段作为探针有规律地排列于固相载体上，将合成aRNA经荧光标记后与其杂交，以计算机系统对杂交信号进行检测分析，从而同时反映上千个基因的表达状况［2］。2013年10月～2014年5月，我们通过盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型，采用基因芯片技术通过大量寡核苷酸探针大规模地检测样品的基因序列及表达信息，从基因水平揭示脓毒症的发病机制，为寻求新的治疗手段提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雄性，120只，清洁级，8～10周龄，体质量(250±10)g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心统一提供，并适应性饲养1周。5%的水合氯醛。分析天平(Mettler AE240)，超纯水系统(Millipore Milli-Q)，小动物手术床(Py2-501213)，18 G穿刺针，注射器，皮针，4-0非吸收性外科缝线。美国Affymetrix大鼠全基因表达谱芯片(Rat Genome 230 2.0)，含有28 000个大鼠基因cDNA克隆，由天津生物芯片技术有限责任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将120只大鼠随机分为假手术组30只、模型组90只，假手术组和模型组根据不同时间点(24、48、72 h)再随机分为3个亚组，每个亚组分别为10、30只。实验前禁食过夜，自由饮水。按照改良 CLP［3～5］复制严重腹腔感染致脓毒症模型。假手术组开腹翻动盲肠后关腹。观察各组大鼠的一般状况。

1.2.2 基因芯片的检测 两组分别于造模后24、48、72 h，无菌条件下取各亚组存活大鼠肝脏组织，速置于液氮中，-70℃保存待检。采用大鼠全基因表达谱芯片检测两组肝组织中的差异表达基因，并对这些基因按其所编码的蛋白质功能予以聚类分析。操作流程:①总RNA的提取和纯化:用Trizol试剂盒抽提液氮中肝组织总RNA，紫外吸收测定法和变性胶电泳法确认RNA纯度及完整性。②反转录并标记探针:利用T7-(dT)24作为引物，在反转录酶的作用下，由RNA反转录成单链cDNA，再以所合成的单链cDNA为模板，RNA片段为引物，在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，并两端补平。利用反转录过程中所加入的T7启动子，在体系中加入T7转录酶进行转录扩增，并同时对产生的aRNA产物进行Biotin标记。③芯片杂交:与Rat Genome 230 2.0芯片杂交。④洗脱芯片:在洗涤工作站FS450上按照芯片类型，运行洗脱程序，对芯片进行清洗、染色和信号放大过程。⑤扫描芯片:用Scanner 3000 7G 4C扫描仪上芯片对芯片进行扫描和信号值转换(将探针信号比的值做以2为底的对数转换，正值为上调，负值为下调)。⑥差异基因的筛选:模型组/对照组倍数变化大于2或小于-2可认为基因的表达存在差异，且绝对值越大，基因表达差异越明显。正值代表基因表达上调，负值代表基因表达下调。

2 结果

2.1 两组一般状况观察 假手术组大鼠术后30 min左右完全苏醒，因腹部疼痛而活动减少，不时舔舐伤口，但数小时后明显好转，饮食饮水正常。模型组术后24 h内，部分死亡，存活者躯体蜷缩，呼吸频率较快，精神萎靡，眼目不睁，不进食水，对刺激反应迟钝;24 h后精神状态较前好转，有少量活动，少量进食饮水。随着时间的延长，多数大鼠眼周出现血性分泌物，排泄稀水样便，色黄、味腥臭，多数病情进一步发展，皮肤松弛，肛温低，排泄物呈黏液状、量多，出现上述症状后短时间内死亡;另有少数大鼠出现腹泻后又停止，进食、饮水量逐渐增加，活动逐渐增多。

2.2 两组肝脏组织中基因表达谱差异 造模24 h，筛选出差异基因671条，免疫相关基因97条(表达上调48条、下调49条);造模48 h，筛选出差异基因133条，免疫相关基因36条(表达上调13条、下调23条);造模72 h，筛选出差异基因204条，免疫相关基因33条(表达上调18条、下调15条)。3个时间点重复基因共58条，免疫相关基因15条(表达上调4条、下调10条、先上调后上调1条)。两组差异表达的部分免疫相关基因，见表1。

3 讨论

CLP模型是研究脓毒症较理想的模型，被认为是进行脓毒症研究的金标准［6～7］。它是由盲肠结扎加穿孔致严重腹膜炎，动物能存活5～10 d，保持了感染源的持续存在，通过少量持续的细菌及肠内容物释放，保证了促炎/抗炎反应的充分发展，形成了符合高代谢、高排低阻和全身炎症反应等临床症状的脓毒症模型。本实验中观察到术后动物活动减少，被毛蓬松少光泽，排泄稀水样便、色黄、味腥臭，脓尿，眼周出现血性分泌，濒死前可出现呼吸困难，对被动仰卧无反抗等;尸解见腹腔有浑浊渗出液，空腔充气甚至坏疽，盲肠肿胀、粘连，穿刺部位引流条明显，肝、肾充血等。CLP模型制备较成功。

本实验发现，在脓毒症大鼠肝组织中，一系列与细胞防御及免疫功能相关的基因表达出现显著改变，它们可能在不同程度上参与了脓毒症大鼠肝损伤的病理生理过程。本实验结果显示，脓毒症时脂多糖结合蛋白(LBP)基因表达上调。其表达产物属脂质结合血清糖蛋白家族，主要功能是识别及结合LPS的脂质A基团，并与细胞膜上或血清中的CD14分子形成复合物，通过跨膜的共刺激分子Toll样受体(TLRs)和细胞内的MAPK蛋白激酶信息传导途径，激活转录因子NF-κB等，启动炎性和免疫反应相关基因的转录［8～11］。增加的 LBP可使细胞对LPS或革兰阴性细菌的敏感性升高，进而增强免疫和炎性反应。另外，本实验中IL-1受体拮抗剂(IL-1RN)表达上调。IL-1是在炎症因子的刺激下所诱导产生的，它主要介导一系列炎症和免疫反应中(IL-1可激活T、B淋巴细胞)所发生的病理、生理学反应。IL-1RN可与IL-1竞争性结合而抑制IL-1的生物活性。IL-1及其受体在体内的动态平衡是维持IL-1正常功能的关键。IL-1RN的高低可反映IL-1在脓毒症中的致病作用，其表达上调则抑制IL-1的生物活性，在一定程度上可抑制IL-1对T、B淋巴细胞的激活作用，抑制机体的免疫功能。

表1 两组差异表达的部分免疫相关基因

本研究发现，免疫系统重要调节细胞T细胞功能失调。脓毒症状态下，淋巴细胞大量凋亡所致淋巴细胞数目减少是造成机体免疫抑制状态的重要原因，表现为非成熟及成熟淋巴细胞出现凋亡。虽然淋巴细胞对外界刺激异常敏感是细胞自身的一种保护机制，但是未成熟T细胞大量凋亡势必引起释放至外周淋巴器官中的成熟淋巴细胞减少，直接和间接损害免疫功能，最终将导致免疫低下状态，该效应以T细胞功能抑制尤为突出。这与李志军等［12］的研究一致。本实验中，脓毒症时S100A8基因表达升高。其表达产物属S100小分子量蛋白家族，主要功能是与钙离子结合，可与多不饱和脂肪酸如花生四烯酸等炎症介质结合，并将其转运至胞外，加剧炎症反应［13］;该反应过程中TNF-α或IL-1又可使S100A8基因高表达，对脓毒症的发展可能起到正反馈作用［1］。

本实验中，模型组α2M表达显著升高。α2M是一种蛋白酶抑制剂，能结合并清除某些过度表达的细胞因子［13］。脓毒症时α2M升高，当过度产生的炎症因子回落近平衡状态且局部微环境稳定时，α2M反射性下调［14］。α2M表达升高为机体的一种自我保护机制。另外，脓毒症发生时，内皮细胞、上皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等产生大量促炎介质，如 IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB1 等［15］，导致免疫平衡受到破坏。各种毒素侵袭使得淋巴细胞发生大量凋亡，免疫系统被广泛抑制，导致病原菌不能及时被清除，感染进一步恶化。本实验以基因芯片技术检测到CLP脓毒症的肝组织中免疫球蛋白重链表达量、聚合体的免疫球蛋白受体表达均下降，细胞免疫相关基因下调，炎症趋化因子及抗炎相关基因上调，它们可能在脓毒症及肝损伤的发病中起了一定的作用。

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