依普利酮对急性肾病大鼠尿蛋白含量及肾小球足细胞标记蛋白表达的影响

王 颖，肖卓韬，施 辉，潘金林

(1南通大学，江苏南通226001;2南通大学附属医院;3南通大学附属丹阳医院)

目前研究认为，足细胞在蛋白尿的发生机制中起重要作用。嘌呤霉素氨基核苷(PAN)肾病模型是一种与人类肾病综合征相似的典型动物模型，有关醛固酮受体(MR)拮抗剂对该模型疗效和治疗机制的研究较多。2013年2月，我们观察了MR拮抗剂依普利酮对PAN急性肾病大鼠尿蛋白和肾小球足细胞标记蛋白表达的影响，以期为肾病综合征防治提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性清洁级SD大鼠32只，6周龄，体质量(200±20)g，购自南通大学实验动物中心，分笼饲养，保持室内相对湿度60% ±5%、温度22℃～25℃，室内12 h明暗自动切换，自由饮水，普通饲料清洁级喂养。PAN(美国ENZO)，依普利酮(美国辉瑞)，兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗鼠Nephrin抗体、兔抗鼠Podocalyxin抗体(均购自美国Santa Cruz公司)，兔抗人足细胞抗体(武汉Boster公司)，DAB试剂盒(北京中衫金桥)，高纯度总RNA快速抽提试剂盒—离心柱型(北京博凌科为)，逆转录试剂盒(美国Fermertas)，荧光定量PCR试剂盒、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs，日本TaKaRa公司)，总蛋白提取液、ECL发光试剂盒、羊抗兔二抗(均购自碧云天生物技术有限公司)。

1.2 动物分组及PAN急性肾病模型建立 采用随机数字表法将大鼠分为对照组(C组)11只、模型组(M组)10只和干预组11只(E组)，后两组均单次腹腔注射PAN(15 mg/100 g)制备PAN急性肾病模型，C组注射等体积生理盐水。造模后第3天开始，E组予依普利酮10 mg/(100 g·d)灌胃，余两组给予等量蒸馏水灌胃，均连续2周。

1.3 标本收集及相关指标检测

1.3.1 24 h尿蛋白检测 利用代谢笼收集大鼠每天尿液，采用考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白定量。

1.3.2 血白蛋白(Alb)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)检测 实验结束后麻醉大鼠，剖腹，自心脏抽取血液标本3～5 mL，分离血清后保存于-80℃冰箱，采用全自动生化分析仪检测Alb、Cr、BUN、TC。

1.3.3 肾组织病理学观察 经心脏抽血完毕后，自左心室灌注生理盐水，取右肾上极并去除包膜，1/3组织以4%多聚甲醛固定、石蜡切片，行PAS染色后400倍光镜下观察;1/3组织经固定、脱水、包埋、固化后切片染色，于电镜下观察;1/3组织置液氮冰冻保存。

1.3.4 肾小球足细胞标志物蛋白检测 ①Nephrin蛋白表达:采用Western blotting法。取上述液氮保存的肾皮质组织100 mg，加入1 mL的RIPA+PMSF(100∶1)于冰上匀浆、裂解半小时，提取组织蛋白，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清用紫外分光光度计测蛋白浓度，按3∶1加入上样缓冲液，100℃水浴10 min后于-80℃冰箱保存。取60 μg蛋白于SDS-PAGE凝胶电泳后转膜至PVDF膜，1%的BSA封闭2 h，TBST洗膜3次后加入一抗兔抗β-actin多克隆抗体(1∶500)、兔抗鼠 Nephrin 抗体(1∶400)，4℃孵育过夜;再次TBST洗膜3次后加入羊抗兔二抗(1∶2 500)，室温孵育2 h后洗膜，按ECL显影剂说明书操作显影。用目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。②Nephrin mRNA表达:采用实时定量PCR法。取液氮保存肾脏组织50 mg，按高纯度总RNA快速抽提试剂盒(离心柱型)说明书提取总RNA并用紫外分光光度计检测260、280 nm处的吸光度(A)值，确定RNA的纯度和量并将其逆转录为cDNA。PCR反应体系为20 μL，95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，40个循环;溶解曲线95℃ 15 s，60℃ 1 h，95℃ 15 s，60℃ 15 s。扩增完毕后，经PCR仪软件系统处理扩增曲线，得到每一样本循环阈值(CT值)，实验重复3次。以GAPDH做为参照，用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。③Podocin和Podocalyxin蛋白表达:采用免疫荧光法。取液氮冻存肾脏组织，冰冻切片机切片、风干，室温下用冷丙酮固定10 min，PBS冲洗2×3 min后滴加兔抗人Podocin抗体、兔抗鼠Podocalyxin抗体，室温避光孵育40 min，同上PBS冲洗，缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜观察，进行半定量评分，其中无色为0分、弱染色为1分、中等染色为2分、强染色为3分。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较用非配对t检验，三组间比较用单因素方差分析，有意义者用Scheffe's F检验对个体之间的差异进行重要性评估。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 24 h尿蛋白定量 实验第7～14天，M组和E组24 h尿蛋白定量均显著高于C组，但E组显著低于M组。详见表1。

表1 三组24 h尿蛋白定量比较(mg，±s)

表1 三组24 h尿蛋白定量比较(mg，±s)

注:与 C 组比较，*P ＜0.01;与 M 组比较，#P ＜0.05

组别 尿蛋白第7天 第14天24 h M 组 201.00 ±24.9* 376.00 ±34.70*E 组 174.00 ±22.5*# 124.00 ±25.80*#C组9.54 ± 5.63 18.00 ± 6.03

2.2 血清Alb、TC、BUN、CrM 组和 E组血清 Alb均显著低于C组，BUN、Cr均显著高于C组;M组TC明显高于C组。详见表2。

表2 三组血清 Alb、TC、BUN、Cr水平比较(±s)

表2 三组血清 Alb、TC、BUN、Cr水平比较(±s)

注:与 C 组比较，*P ＜0.05，#P＜0.01

组别 Alb(g/L) TC(mmol/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)M 组 16.6 ±7.09# 2.72 ±0.07#7.48 ±0.84* 34.0 ±1.44*E 组 17.2 ±5.71# 1.74 ±0.03* 7.21 ±1.23* 26.4 ±0.65*C组31.8 ±4.33 1.78 ±0.04 6.40 ±0.66 20.5 ±1.03

2.3 肾脏组织病理表现 PAS染色显示，M组大鼠未见慢性肾病的组织病理改变，肾小球基本正常，符合微小病变肾病(MCD)病理表现。电镜检查显示，M组大鼠足突广泛融合、消失，局部基底膜裸露;E组部分足突变短、超微结构改善，但融合仍多见。

2.4 Podocin、Podocalyxin蛋白表达 M 组和 E组Podocin和Podocalyxin蛋白表达明显均低于C组，尤以M组为著。详见表3。

表3 三组Podocin、Podocalyxin蛋白表达比较(分，±s)

表3 三组Podocin、Podocalyxin蛋白表达比较(分，±s)

注:与 C 组比较，*P ＜0.05;与 M 组比较，#P ＜0.05

组别 Podocin蛋白 Podocalyxin 蛋白M 组 1.00 ±0.66* 0.90 ±0.57*E 组 1.81 ±0.75*# 2.00 ±0.63*#C组3.00 ±0.00 3.00 ±0.00

2.5 Nephrin蛋白及mRNA表达 M组和E组Nephrin蛋白及mRNA表达均明显低于C组，尤以M组为著。详见表4。

表4 三组Nephrin蛋白及mRNA表达比较(±s)

表4 三组Nephrin蛋白及mRNA表达比较(±s)

注:与 C 组比较，*P ＜0.05;与 M 组比较，#P ＜0.05

组别 Nephrin蛋白Nephrin mRNA M 组 0.65 ±0.46* 0.47 ±0.04*E 组 0.84 ±0.39*# 0.53 ±0.03#C组0.96 ±0.32 0.97 ±0.09

3 讨论

足细胞是肾小球过滤屏障的主要组成部分，其损伤可导致大量蛋白尿，而蛋白尿增加又与肾小球疾病的进展密切相关［1］。研究发现，许多毒物、抗体、补体因子和机械压力等因素均能导致足细胞损伤;Mundel等认为足细胞损伤主要包括以下四方面:①裂孔隔膜蛋白复合物成分及结构的改变;②肌动蛋白细胞骨架结构破坏;③足细胞与肾小球基底膜组成成分及相互作用方式改变;④足细胞表面负电荷屏障受损。PAN肾病模型是目前较理想的模拟人类急性肾病综合征的动物模型，其病理过程和临床表现分别以足细胞损伤和大量蛋白尿为主。本研究通过给SD大鼠腹腔静脉单次注射PAN建立MCD模型，结果实验第7天大鼠尿蛋白显著增加并持续至第14天，同时血清Alb水平显著下降，TC、Cr明显升高，与文献报道一致，提示造模成功。此外，本研究M组光镜下未见肾小球毛细血管袢肥大、系膜细胞增生、细胞外基质增多、基底膜增厚、肾小管扩张等慢性肾病的组织病理改变，符合MCD病理表现;电镜下肾脏组织可见足突广泛融合、消失，部分足细胞脱落，基底膜裸露。故上述模型蛋白尿程度与肾组织病理变化程度相符。

Nephrin与特异性脂筏在细胞膜的正常分布对于维持正确的信号通路非常重要。近年来有关肾小球滤过屏障的分子结构及其功能的研究［2］进展迅速，这些蛋白分子表达变化和(或)分子结构改变均可导致肾小球滤过屏障结构和功能异常。Podocin分布异常是足细胞损伤过程中的重要分子效应。有学者等［3］发现，Podocin分布异常与足细胞损伤密切相关，足细胞损伤早期Podocin即有改变。Podocalyxin是足细胞上最特异的标志蛋白、足细胞表面的主要组成成分，其可与其他蛋白在足细胞表面形成阴离子外衣，并通过电荷的相斥作用保持足突间的距离、控制足细胞裂孔的开放、维持肾小球囊腔的空间结构和功能。研究［4］表明，Podocalyxin可与多种足细胞蛋白以复合体形式调节足细胞和裂隙膜的结构。本研究显示，实验第14天M组Nephrin蛋白、mRNA表达及Podocin、Podocalyxin蛋白表达均较C组明显下降。提示 Nephrin、Podocin、Podocalyxin表达与肾小球足细胞损伤有关。

后天性足细胞病(如原发性局灶性节段性肾小球硬化和MCD)目前被广泛认为是免疫介导的疾病，常规免疫抑制剂常可产生多种毒副作用，患者治疗依从性不高。近年来，MR拮抗剂对肾小球过滤屏障的作用逐渐得到重视［5］。Kang 等［6］发现，依普利酮和替米沙坦治疗后大鼠尿蛋白排泄率和蛋白尿减少，且依普利酮对醛固酮导致的足细胞凋亡有保护作用。Nagase对基因敲除小鼠的研究提示，MR激动在慢性肾脏病的病理过程起关键作用，表现为蛋白尿、足细胞损伤和肾小球硬化;盐皮质激素受体拮抗剂依普利酮可缓解非血清醛固酮浓度升高所致肾内MR信号通路表达增强。因此，MR可能经依赖醛固酮(经醛固酮释放因子)和非依赖醛固酮途径(通过GTPase Rac1通路)激活［7］。本研究发现，依普利酮干预可逆转PAN肾病大鼠的足细胞形态及标记蛋白表达。可能机制为依普利酮具有下列作用:阻断MR 信号，减轻醛固酮的细胞毒作用［8～10］;通过减轻肾小球的超滤作用［11，12］减轻高血压患者的蛋白尿，对于合并糖尿病高血压患者的肾脏保护作用更为明显;在药理浓度下不抑制肾上腺细胞对醛固酮和皮质醇的分泌［13，14］;通过改善脂质过氧化影响 SGK1 信号通路［15，16］。

综上所述，依普利酮能够明显减少PAN肾病大鼠的尿蛋白，可能机制为上调足细胞标记蛋白表达和活性。

［1］Thomas MC.Pathogenesis and progression of proteinuria［J］.Contrib Nephrol，2011，170(1):48-56.

［2］王玉洁，曹灵，孙兴旺.足细胞与蛋白尿发病机制的研究进展［J］.山东医药，2012，52(19):90-92.

［3］Rafiq K，Hitomi H，Nakano D，et al.Pathophysiological roles of aldosterone and mineralocorticoid receptor in the kidney［J］.J Pharmacol Sci，2011，115(1):1-7.

［4］ Ye P，Yamashita T，Pollock DM，et al.Contrasting effects of eplerenone and spironolactone on adrenal cell steroidogenesis［J］.Horm Metab Res，2009，41(1):35-39.

［5］Liang W，Chen C，Shi J，et al.Disparate effects of eplerenone，amlodipine and telmisartan on podocyte injury in aldosterone-infused rats［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26(3):789-799.

［6］Kang YS，Ko GJ，Lee MH，et al.Effect of eplerenone，enalapril and their combination treatment on diabetic nephropathy in typeⅡdiabetic rats［J］.Nephrol Dial Transpl，2009，24(1):73.

［7］Kiyomoto H，Rafiq K，Mostofa M，et al.Possible underlying mechanisms responsible for aldosterone and mineralocorticoid receptor-dependent renal injury［J］.J Pharmacol Sci，2008，108(4):399-405.

［8］Fang Z，Zhang C，He F，et al.Protective effects of eplerenone on podocyte injury in adriamycin nephropathy rats［J］.J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci，2011，31(3):329-334.

［9］Tesch GH.Review:serum and urine biomarkers of kidney disease:a pathophysiological perspective［J］.Nephrology(Carlton)，2010，15(6):609-616.

［10］Mathieson，PW.The podocyte as a target for therapies-new and old［J］.Nat Rev Nephrol，2012，8(1):52-56.

［11］Nagase M，Fujita T.Endocrinological aspects of proteinuria and podocytopathy in diabetes:role of the aldosterone/mineralocorticoid receptor system［J］.Curr Diabetes Rev，2011，7(1):8-16.

［12］Gao F，Maiti S，Sun G，et al.The Wt1+/R394W mouse displays glomerulosclerosis and early-onset renal failure characteristic of human Denys-Drash syndrome［J］.Mol Cell Biol，2004，24(22):9899-9910.

［13］Jain G，Campbell RC，Warnock DG.Mineralocorticoid receptor blockers and chronic kidney disease［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2009，4(10):1685-1691.

［14］Nagase M.Activation of the aldosterone/mineralocorticoid receptor system in chronic kidney disease and metabolic syndrome［J］.Clin Exp Nephrol，2010，14(4):303-314.

［15］Ahn JH，Hong HC，Cho MJ，et al.Effect of eplerenone，a selective aldosterone blocker，on the development of diabetic nephropathy in type 2 diabetic rats［J］.Diabetes Metab J，2012，36(2):128-135.

［16］Lee MY，Shim MS，Kim BH，et al.Effects of spironolactone and losartan on diabetic nephropathy in a type 2 diabetic rat model［J］.Diabetes Metab J，2011，35(2):130-137.