Tiam1-Rac1在乳腺癌组织中的表达及意义

何雄斌，方 力，胡雄强，吴海燕

(郴州市第一人民医院，湖南郴州423000)

近年来有关乳腺癌侵袭转移相关因子的作用机制及抑制乳腺癌转移的分子靶标成为研究热点。研究发现，T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)和Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)均与乳腺癌的侵袭转移密切相关，但对二者的相关性及其在乳腺癌侵袭转移中共同的临床意义国内外研究鲜见报道。为此，我们进行了如下研究。

1 材料和方法

1.1 材料 2012年1月～2013年8月郴州市第一人民医院病理科保存的97例份乳腺癌手术切除的石蜡包埋标本(乳腺癌组)，均经组织病理学确诊(患者均为女性，年龄28～72岁，平均45岁;术前均未行化疗、放疗、内分泌治疗;肿瘤直径≤2 cm者42例，＞2 cm者55例)。病理类型:浸润性导管癌78例，浸润性小叶癌12例，髓样癌4例，黏液癌3例。病理分级:Ⅰ级16例，Ⅱ级52例，Ⅲ级29例;临床分期:Ⅰ期19例、Ⅱ期43例、Ⅲ期35例;伴腋窝淋巴结转移者48例。另收集同期正常乳腺组织标本20份(正常组)，乳腺增生标本20份(增生组)。主要试剂:Tiam1兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，工作浓度1∶100;兔抗人 Rac1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，工作浓度1∶800。即用型非生物素免疫组化EliVisionTMplus免疫组化检测试剂盒，购自福州迈新生物技术开发公司;DAB显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Tiam1及Rac1表达检测 标本经4%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，石蜡标本连续切片3张，切片厚度为4 μm，一张行常规HE染色，另两张分别行Tiam1、Rac1免疫组化染色，65℃烤片7 h以上后行免疫组化染色，按试剂盒说明书操作，以PBS代替一抗的乳腺癌组织免疫组化染色结果为阴性对照。Tiam1和Rac1蛋白阳性染色为在细胞膜和细胞质中呈现黄色或棕色颗粒，境界清楚，无明显背景染色。评估标准［1］:①按染色强度计分:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分;②按阳性染色细胞百分率计分:高倍镜下每张切片选择10个有代表性的视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计数1 000个细胞。阳性细胞数＜10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。①、②计分的乘积为0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，大于5分为强阳性(+++)。最终结果由2位病理医师采用用双盲法判定。

1.2.2 相关性分析 分析Tiam1和Rac1表达与乳腺癌临床病理参数的关系、Tiam1和Rac1表达强度与淋巴结转移的关系及Tiam1与Rac1表达的相关性。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0分析软件。免疫组化数据采用χ2检验及四格表确切概率法，相关性采用Spear-man等级相关分析。检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 Tiam1及 Rac1表达 乳腺癌组 Tiam1/Rac1蛋白染色呈淡黄、棕黄或黄褐色阳性颗粒，颜色浓淡不一，不均一分布于癌细胞的胞膜及胞质中;Tiam1以胞质表达为主，胞膜表达不明显。正常组Tiam1和Rac1蛋白阳性率分别为40%、46% ，增生组分别为35%、30%，乳腺癌组分别为 76.3%、79.4%，乳腺癌组均明显高于另两组(P均＜0.01)。

2.2 Tiam1和Rac1表达与乳腺癌临床病理参数的关系 Tiam1和Rac1表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、病理类型无关，与肿瘤分级、TNM分期及淋巴结转移显著相关。见表1。

表1 Tiam和Rac1表达与乳腺癌病理参数的关系

2.3 相关性分析 Tiam1与Rac1在乳腺癌组织中的表达呈明显正相关(r=0.247，P=0.012)，见表2。乳腺癌组Tiam1和Rac1蛋白均阳性者63例，其淋巴结转移率为65.08%(41/63);Tiam1和Rac1蛋白同时阴性者9例，其淋巴结转移率为11.1%(1/9)，二者比较P＜0.05。随Tiam1和Rac1蛋白染色阳性强度的逐渐增强，乳腺癌淋巴结转移率呈现出逐渐增高的趋势，组间比较差异有统计学意义，见表3。

表2 乳腺癌组Tiam1和Rac1蛋白表达的关系(例)

表3 Tiam1和Rac1表达强度与淋巴结转移率的关系

3 讨论

Tiam1基因由荷兰癌症研究所Habets等首先由BW5147小鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中鉴定出来，定位于染色体21q22.1，其所编码的蛋白质是目前公认的一种普遍存在的二磷酸鸟嘌呤核苷酸(GDP)与三磷酸鸟嘌呤核苷酸(GTP)转换因子(GEF)，属于 Dbl(diffuse B-cell lymphoma oncogenefamily)家族成员之一，是Ras超家族的催化剂。近年来研究发现，Tiam1在多种肿瘤细胞系中均明显高表达，并在恶性肿瘤的侵袭和转移中起重要作用。关于其在乳腺癌组织中的表达国内外也有相似报道，Adam等［2］采用蛋白免疫印迹法研究发现，Tiam1在乳腺癌瘤组织中呈过度表达，肿瘤组织分级为Ⅲ级者表达水平明显高于Ⅱ级者，表明Tiam1的表达与乳腺癌的恶性程度密切相关，吴元清等［3］检测了126例乳腺癌组织中Tiam1的表达情况，也发现Tiam1与乳腺癌淋巴结的转移密切相关。本研究发现Tiam1在乳腺癌组织中表达明显高于正常乳腺组织及乳腺增生组织，且Tiam1表达与乳腺癌的组织分级、TNM分期及淋巴结转移显著相关;与文献报道结果相符。

Rac1属Rac亚家族，定位于染色体7q22，是Rho蛋白家族中的重要成员，具有与Ras相似的作用，其蛋白全称为Ras相关的肉毒素底物1，存在失活和激活两种状态，并与细胞移动的关系密切。Rac1的激活可引起一系列下游信号的转导，如JNK激酶(c-jun N-terminal kinase)、p38蛋白激酶、MAPK(丝裂素活化蛋白激酶)等在细胞骨架重组，细胞黏附与运动，基因表达调控，甚至恶性肿瘤的形成、生长、侵袭、转移中发挥重要作用［4，5］。研究显示在各种细胞外信号刺激下 Tiaml可以特异性地激活Racl，并通过Tiaml/Racl信号转导通路激活其下游的一系列的信号分子从面发挥重要的生物学功能。钟大平等［6］在研究Tiam1和Rac1在大肠癌中的表达时发现，二者在基因和蛋白水平均呈明显正相关，并与肿瘤淋巴结转移、浸润深度和Duke分期相关。国内众多学者也在卵巢癌［7］、肺癌、胃癌［8］、食管鳞癌［9］、宫颈鳞癌［10］及骨肉瘤［11］等恶性肿瘤的研究中发现，Tiam1与Rac1表达呈明确的正相关，还与恶性肿瘤的浸润、侵袭和转移密切相关。本研究发现，与正常乳腺组织及乳腺增生组织相比Rac1在乳腺癌组织中呈高表达，其表达与乳腺癌的组织分级、TNM分期及淋巴结转移也显著相关;二者在乳腺癌的表达中也呈明显的正相关。为进一步明确二者的关系，我们比较了Tiam1和Rac1均阳性癌患与均阴性的乳腺癌患者的淋巴结转移率，结果显示Tiam1和Rac1均阳性者淋巴结转移率明显高于均阴性者，提示Tiam1和Rac1蛋白在乳腺癌的侵袭转移中具有协同作用。本研究我们还意外发现随着乳腺癌Tiam1和Rac1蛋白染色强度的增强，乳腺癌淋巴结转移率也呈逐渐升高的趋势。

综上所述，Tiam1和Rac1在乳腺癌的发生、发展中起重要作用，联合检测Tiam1和Rac1在乳腺癌组织中的表达情况及其阳性强度，对于预测乳腺癌的预后，尤其是乳腺癌的侵袭转移具有重要的指导意义。

［1］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症杂志，1996，6(4):229-231.

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［11］王剑锋，张春礼.Tiam1和Rac1在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义［J］.中国实验诊断学，2011，15(4):665-668.