固相萃取柱测定复方甘草口服液中吗啡含量效果

袁红英，关景丽，杨雪萍，孙 昕，刘 卫，吕泰省

固相萃取（solid phase extraction，SPF）是一种试样预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，具有高效性、高选择性、高自动化程度和低耗性等优点。目前SPE技术有SPE柱、SPE盘和固相微量萃取等形式，其中使用最普遍是SPE柱。SPE柱是一种填充好固定相的短色谱柱，利用组分与吸附剂间选择性吸附与选择性洗脱的过程，达到提取分离、净化和富集的目的［1］。

复方甘草口服液由甘草流浸膏、复方樟脑酊、甘油、愈创甘油醚、浓氨溶液和水按一定比例配制而成，属祛痰镇咳药。由于疗效确切，在临床广泛应用，深受患者的欢迎。《中华人民共和国药典》2010年版二部［2］规定对其中的吗啡、愈创甘油醚、甘草酸进行含量测定。由于成分复杂、干扰多，在吗啡含量测定中利用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂的SPE柱进行除杂。在除杂的吸附与解吸过程中SPE柱的填料粒度、孔隙率等对样品的洗脱率有很大影响。不同厂家、不同规格的SPE柱对吗啡的洗脱率有较大不同。本实验对2个不同厂家的SPE柱在相同条件下对复方甘草口服液中吗啡的洗脱率进行比较分析，并对常压、抽负压两种方法处理固相萃取柱的结果比较。

1 仪器、试剂与样品

安捷伦1200高效液相色谱仪 （四元泵，自动进样），VWD检测器，C18固相萃取柱 （Agilent Technologies 500mg/6ml SPE09400204、大连思谱精工有限公司 500 mg/6 ml SPE100119），超声清洗器（TCQ－250），吗啡对照品（中国药品生物制品检定所分装产品，供含量测定用），乙腈为色谱纯，甲醇、庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾、氨水、醋酸均为分析纯，复方甘草口服液（笔者所在医院制剂室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及检测方法 辛烷基键和硅胶色谱柱（GL Sciences 4.6×150 mm，5 μm）； 流动 相：0.0025 mol/L 乙腈，0.05 mol/L 庚烷磺酸钠溶液，5∶18∶18 磷酸二氢钾溶液； 流速为 1.0 ml/min；检测波长 220 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 称取吗啡对照品适量，精密称定，加 5%醋酸溶液，制成 0.1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 固相色谱柱的处理 取固相萃取柱，依次用甲醇－水（3∶1）15 ml与水5 ml冲洗，再用pH值约为9的氨水溶液（取水适量，滴加氨试液至pH值为9）冲洗至流出液pH为9，待用。

2.2.3 供试品溶液的制备

2.2.3.1 系统适应性试验样品溶液制备 精密量取上述对照品溶液0.5 ml，置处理后的固相萃取柱上，滴加氨试液适量使柱内溶液的pH值为9（上样前另取同体积的续滤液预先调试，以确定滴加氨试液的量），待溶剂滴尽后用水20 ml冲洗，再用5%醋酸溶液洗脱。用5 ml量瓶收集洗脱液至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。

2.2.3.2 样品溶液制备 取复方甘草口服液适量，超声处理10 min，取出，摇匀，精密量取 0.5 ml，置固相萃取柱上，同法洗脱，用5 ml量瓶收集洗脱液至刻度，摇匀，作为样品溶液。

2.3 系统适应性试验 分别取Agilent Technologies固相萃取柱、大连思谱精工固相萃取柱各2支，按上述方法制备系统适用性试验样品溶液。精密量取上述溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积积分值，并根据系统适用性试验结果公式 f（s）＝（AX/CX）/（AR/CR）（AX为系统适用性试验吗啡峰面积；CX为系统适用性试验溶液浓度；AR为对照品溶液吗啡峰面积；CR为对照品溶液浓度；），计算f（s）值并进行比较。结果见表1。

表1 固相萃取柱系统适用性试验结果

2.4 固相萃取柱处理方法考察 固相萃取柱使用前需活化、碱化。常压下固相萃取柱滴速较慢，耗时较长，给使用带来较大不便。在试验过程中采用抽负压和常压两种方式处理固相萃取柱，对吗啡对照品进行吸附洗脱，并注入高效液相色谱仪记录色谱图及峰面积积分值。比较两种处理方式吗啡含量的影响，并计算洗脱率。见表2。

2.5 三批样品溶液含量测定 分别吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表 3、图 1。

3 讨 论

3.1 固相萃取柱对吗啡含量测定的影响 不同厂家的C18固相萃取柱对吗啡吸附洗脱能力有较大不同，Agilent Technologies固相萃取柱对吗啡含量影响较大，f（s）仅为69%左右，不宜在复方甘草口服液吗啡含量测定中使用。大连思谱精工固相对吗啡含量影响较小，f（s）近100%，可以在复方甘草口服液吗啡含量测定中使用。鉴于以上结果，在测定前进行系统使用性试验时非常必要的。

表2 两种方法处理固相萃取柱结果

表3 三批样品含量测定结果

图1 高效液相色谱图

3.2 常压、抽负压处理C18固相萃取柱对吗啡含量测定的影响 常压、抽负压处理C18固相萃取柱对吗啡含量测定结果影响不大，吗啡的吸附洗脱率均接近100%。常压处理固相色谱柱约需20 h，抽负压处理仅需要1 h，极大地缩短了处理时间，提高了工作效率。不同厂家的固相萃取柱对吗啡含量影响较大。常压、抽负压两种方式处理固相萃取柱对吗啡含量测定无影响。

［1］王 蕾，郭丽冰.固相萃取形式应用概况［J］.河南中医学院学报，2007，22（4）：86－88.

［2］中华人民共和国药典委员会.中国药典（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.574－575.