快速高效提取并检测银杏内酯的一种新方法＊

王 琳，朱 缨，吴纪凯

本研究旨在寻找一种快速简便、适用于大生产的方法从银杏叶中提取、分离、检测银杏内酯和白果内酯，为参银复智制剂的研制提供帮助，也为制备银杏叶提取物的研究者提供参考。

1 实验材料

1.1 试剂与原料 大孔吸附树脂 D101、AB－8、D201、聚酰胺树脂均为工业级，乙腈为色谱纯（Merck公司），其他试剂均为分析纯，水为Millipore超纯水。

银杏叶药材由苏州天灵中药饮片公司提供，银杏叶内酯 A（GA）、银杏叶内酯 B（GB）、银杏叶内酯C（GC）和白果内酯（BB）对照品购至 sigma公司，纯度＞98%。

1.2 仪器 液相色谱仪为Waters Acquity UPLC system，包括二元泵处理器、样品处理器、柱温箱、ELS检测器以及Empower色谱工作站；W14M－2电子恒温水浴锅（sheldon manufacturing.Inc.）；RE200型旋转蒸发仪（瑞士产）；ZK一2A型真空干燥器 （上海实验仪器厂）；CP225D电子天平（Sartorius 公司）；PB-10 型酸度计（Sartorius）；摇床（Labnet orbit LS）。

2 试验方法与结果

2.1 银杏萜类内酯的UPLC－ELS测定

2.1.1 供试品溶液的制备 根据前期正交试验结果及文献［2］报道选择以下方法提取银杏叶内的内酯类成分：银杏叶适当粉碎，加入7倍量70%乙醇溶液回流提取2次，3 h/次，合并提取液，减压回收乙醇，加适量水至3倍药材量水沉，静置，过滤，浓缩至一定体积，浓缩液低温贮存待用。

分别吸取等量浓缩液按1 BV/h的流速上不同类型树脂柱吸附，先用水洗2 h，取一定浓度的乙醇溶液，按1 BV/h洗脱，分别收集一个柱床体积的洗脱液，减压浓缩后以甲醇定容，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

1.1 一般资料 选取2017年9月至2018年4月在西南医科大学附属医院就诊的各类癌症患者269例，其中男150例，女119例，年龄44～77岁；其中乳腺癌53例，肝癌 86例，肺癌87 例(小细胞肺癌41例，鳞癌17例，腺癌29例)，白血病43例，均经病理诊断及其他手段确诊且未经放化疗。选取肺部良性疾病患者57 例，年龄48～73岁，其中支气管炎患者22例，慢性阻塞性肺疾病17例，肺炎18例，并排除其他严重系统疾病及恶性肿瘤。另以同期30例健康体检人员作为健康对照组，年龄22～28岁，经证实均无心脏、肝、肾等其他系统疾病。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：waters BEH C18，2.1×50 mm，1.7 μm；流动相：甲醇－四氢呋喃－水（25∶5∶70）；流速：0.3 ml/min；柱温：30 ℃；蒸发光散射检测器（ELSD）；漂移管温度：80℃； 载气：氮气；流速：2.5 L/min；进样量：5 μl。

2.1.3 线性考察 取银杏内酯 A、B、C和白果内酯对照品适量，甲醇溶解，精密吸取混合对照品溶液适量，分别配制成不同浓度，按上述色谱条件依次进样，分别重复3次。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得到银杏内酯A、B、C 和白果内酯的回归方程、相关系数（r）和线性范围，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

图1 供试品（A）和对照品（B）的UPLC图

2.1.4 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于 0、1、2、4、6、8、24、48 h 进样测定，结果白果内酯、银杏内酯A、B、C平均峰面积的RSD分别为2.7%、2.4%、1.9%和 2.0%（n＝6）， 表明供试品在 48 h 内基本稳定。

2.1.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5 μl，重复进样5次。结果，白果内酯、银杏内酯A、B、C平均峰面积的RSD分别为0.9%、1.2%、1.4%和1.7%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2 银杏萜类内酯分离工艺研究 吸附树脂的吸附性能与被吸附分子的极性、分子大小、吸附剂的极性、比表面积、孔径大小等因素有关，而且吸附树脂因其结构和基团不同，或者生产厂家不同，吸附能力也有所区别，为了分离、富集、纯化银杏叶中的萜类内酯，笔者收集了部分国内不同厂家不同型号的吸附树脂，通过对银杏叶萜类内酯的吸附与分离性能的研究，筛选出较为理想的树脂和分离工艺。

2.2.1 大孔吸附树脂的预处理和再生 在吸附树脂生产过程中一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步净化处理，因此吸附树脂内部往往残留少量单体、致孔剂和其他有机物杂质，在产品贮存期间，为防止细菌、真菌的生长，有时加入碱等防腐剂［3］。因此，在树脂使用之前，必须进行预处理，以除去制备和贮存中引入的杂质。一般预处理如下：吸附树脂水合：吸附树脂通常以湿态保存，如果暴露在空气中，树脂可能部分干燥失水。为使树脂再度水合，应把脱水的吸附树脂充分浸泡，以便从孔中赶出空气泡。浸泡之后，用水冲洗取代乙醇，水洗，以除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物。

当树脂的吸附能力降低或受严重污染时需对树脂进行强化再生，其方法是：在容器内加入高于树脂层10 cm的3%～5%盐酸溶液浸泡2～4 h，然后进行二次水淋洗，至接近中性。再用3～4倍树脂体积同浓度的盐酸溶液通柱，然后用二次水洗至接近中性；再用3%～5%的氢氧化钠溶液浸泡4 h，后用二次水清洗至pH值为中性，备用即可。取一定量的树脂，用95%的乙醇溶液浸泡24 h，然后用乙醇洗涤，直到洗出液中加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇；然后依次用4%Na0H、5%HCL浸泡2～4 h，分别用蒸馏水洗至中性，备用。

2.2.2 吸附树脂装柱步骤 一般吸附柱由玻璃制成。在装柱之前应先在柱中加入一定量的水，然后将带水的吸附树脂浆液倒入柱中，一般按下列步骤进行：①树脂－水浆液加入已带有定量水的吸附柱中；②把过量的水通过柱底放出，保持水面高于树脂层面3 cm以上直到所有树脂全部转移到柱中。

2.2.3 吸附树脂的选择 分别称取3 g处理好的AB－8、D101、D201、聚酰胺四种干大孔树脂于 100 ml具塞三角瓶中，量取银杏叶提取浓缩液50 ml置于恒温摇床中，25℃下以一定的速度振摇24 h后进行过滤，参照2.1的条件制备供试品，测定GA、GB、GC和BB的峰面积，并代入相应的线性方程计算吸附平衡后溶液中银杏内酯的浓度。根据以下公式计算吸附量。

将吸附平衡的树脂立刻放入磨口三角瓶中，再振荡24 h，然后再将树脂滤出，测定洗脱液中GA、GB、GC和BB浓度，根据以下公式计算解吸率。

吸附量＝（C0－C）×V/m（mg/g）

解吸率＝［V1C1/（C0－C）V］×100%

其中C0和C分别为树脂吸附前后银杏内酯粗提物液中各类银杏内酯的浓度，C1为15%乙醇溶液解吸附后溶液中各类银杏内酯的浓度；V为银杏内酯粗提物液的体积 （50 ml），V1为洗脱液体积（200 ml）；m 为干树脂质量（3 g）。

表2 4种大孔树脂对银杏叶萜类内酯的静态吸附效果

从实验结果可以看出：聚酰胺吸附树脂对银杏叶中萜类内酯有较好的吸附作用，加之较高的解吸率（达到90%以上），能达到对银杏叶中内酯类物质的富集纯化作用。因此，笔者选用聚酰胺吸附树脂进行银杏内酯类物质的动态吸附实验研究。

2.2.4 洗脱剂及洗脱浓度的选择 内酯类化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂，考虑到甲醇的毒性和丙酮的挥发性及溶解性，本实验中采用乙醇－水为洗脱溶剂，对已吸附的树脂按1 BV/h的流速上柱吸附，先用水洗2 h，再用不同浓度洗脱剂自上而下进行洗脱，分别收集不同浓度的洗脱剂的洗脱液，真空干燥，测定萜类内酯的总含量（银杏内酯A、B、C和白果内酯的含量之和）。实验结果见图2。

图2 洗脱剂浓度对银杏内酯含量的影响

通过实验可知，乙醇浓度在5%～10%基本上可以将内酯洗脱下来，银杏萜类内酯有效部位的含量高，考虑到用5%乙醇溶液洗脱时需较大体积，故采用10%为洗脱溶剂。

2.2.5 洗脱剂用量的选择 考虑到洗脱剂对分离效果的影响，笔者分别对10%的乙醇浓度，以1BV、2BV、3BV、4BV、5BV 进行研究，结果见表 3。

表3 洗脱剂用量的影响

从理论上讲，洗脱剂用量越多越好，能将吸附质量解析下来，但过量的洗脱剂后处理带来麻烦，起不到浓缩的效果，同时过量的溶剂会将银杏叶内的其他成分洗脱下来，降低银杏萜类内酯的纯度，从表3可知2～3倍已能将内酯洗脱下来。

2.2.6 最佳分离工艺条件的验证 最佳工艺条件为银杏叶采用7倍70%乙醇溶液回流提取2次，3 h/次，合并提取液，减压回收乙醇，加3倍量水，水沉，过滤，浓缩，然后上己处理好的聚酰胺树脂，2倍水洗后，用2～3倍树脂床体积10%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，检测含量，按此条件，试制3批，结果银杏萜类内酯的含量都在35%以上，有效部位得率在90%以上，与所用银杏叶原料中有效成分含量成正相关。

由上可知，该项技术稳定可靠，能够较经济地达到银杏萜内酯的有效分离。

3 讨 论

3.1 UPLC法测定的优点［4］与 HPLC法比较，UPLC－ELSD法在检测银杏叶萜类内酯时有几个优点：超高分离度、超高速度、超高灵敏度。常规HPLC法测定银杏时萜类内酯的含量一般需要0.5～1 h的时间，样品组分才能得到较好的分离；而采用UPLC法只需15 min就能得到更好的分离效果和分析结果。

3.2 树脂分离的优点 UPLC法只采用一次柱分离，结晶纯化即可连续制得纯度达35%以上的银杏萜类内酯。工艺操作中只采用无毒试剂水和乙醇，对产品药用提供了安全保障。由于采用的是可重复使用的大孔树脂，使生产成本大大降低。本工艺简便，采用有机试剂少。因此适用于中试及工业生产，为大规模开发银杏萜内酯药品奠定了良好基础。

［1］王 琳，范洤彬.一种治疗血管性痴呆的组合物及其制备方法［P］.中国，201010132782.6：2010－06－09.

［2］陈 红，孙黎清，董自波.银杏叶总黄酮苷和萜内酯类化合物最佳提取工艺研究［J］.中国药业，2007，16（14）：47－48.

［3］苏 静，谈 锋，李连强，等.高速逆流色谱法分离纯化银杏叶中白果内酯和银杏内酯 A、B、C［J］.2008，39（11）：1644－1648.

［4］赵一懿，郭洪祝，王京辉，等.超高效液相色谱法同时测定银杏叶提取物中11种黄酮苷类成分的含量［J］.中国药学杂志，47（24）：2032－2037.